Podłoże, przygotowanie i zastosowanie agaru Sabourauda

2971
Abraham McLaughlin

Plik Agar Sabourauda, znany również jako agar dekstrozowy Sabourauda, ​​jest to stałe podłoże hodowlane, specjalnie wzbogacone do izolacji i rozwoju grzybów, takich jak drożdże, pleśnie i dermatofity..

Dlatego nie może zabraknąć tego pożywki w laboratorium mikrobiologicznym do badania obecności patogennych lub oportunistycznych grzybów, zarówno w próbkach klinicznych, jak i nieklinicznych. Jest również idealny do wzrostu bakterii nitkowatych, takich jak Streptomyces i Nocardias. Ma bardzo szerokie zastosowanie, gdyż może być stosowany w mikologii ludzi, zwierząt, roślin i przemysłowych.

A. Agar Sabourauda bez nasion. B. Agar Sabourauda wysiany drożdżami. Źródło: Zdjęcia autorstwa mgr inż. Marielsa gil

Pożywka ta została stworzona w 1896 roku przez wybitnego dermatologa Raimonda Sabourauda, ​​który stał się światowej sławy specjalistą w chorobach skóry głowy, głównie wywoływanych przez dermatofity..

Jego powstanie było na tyle ważne, że był używany od tamtej pory i pozostaje do dziś, choć z pewnymi modyfikacjami.

Chociaż jest to szczególne dla grzybów, bakterie mogą rosnąć w tym podłożu, dlatego w przypadku próbek z mieszaną florą wymagane jest włączenie antybiotyków do ich przygotowania, a tym samym zahamowanie wzrostu flory bakteryjnej, która może być obecna..

Wyboru antybiotyku należy dokonać ostrożnie i wziąć pod uwagę rodzaj grzyba, który ma zostać odzyskany, ponieważ niektóre substancje są hamowane przez obecność niektórych substancji.

Indeks artykułów

  • 1 Uzasadnienie
    • 1.1 Najczęściej używane kombinacje agaru Sabouraud z dekstrozą i antybiotykami
  • 2 Przygotowanie
    • 2.1 Agar Sabouraud z dekstrozą 
    • 2.2 Agar Sabouraud z dekstrozą (modyfikacja Emmonsa)
    • 2.3 Agar Sabourauda z dekstrozą (modyfikacja Emmonsa) z chloramfenikolem
    • 2.4 Agar Sabouraud Emmons Dextrose Agar z cykloheksymidem
    • 2.5 Agar Sabouraud z dekstrozą (Emmons) z chloramfenikolem i cykloheksymidem
    • 2.6 Inne antybiotyki, które można dodać
  • 3 Uwagi specjalne
  • 4 Kontrola jakości
  • 5 zastosowań
    • 5.1 Kultura pierwotna
    • 5.2 Sporulacja
    • 5.3 Konserwacja
    • 5.4 Mikrokultury
    • 5.5 W mikologii człowieka
    • 5.6 Mikologia zwierząt
    • 5.7 Mikologia środowiska
    • 5.8 Mikologia przemysłowa
    • 5.9 Mikologia roślin
  • 6 Odnośniki

Podstawa

Agar Sabouraud z dekstrozą jest pożywką, która w swoim pierwotnym składzie jest słabo selektywna ze względu na kwaśne pH 5,6 ± 0,2, jednak bakterie mogą nadal się rozwijać, głównie podczas długotrwałych inkubacji.

Pożywka zawiera pepton kazeinowy i trzustkowy hydrolizat tkanki zwierzęcej, które są źródłem węgla i azotu dla wzrostu mikroorganizmów..

Zawiera również wysokie stężenie glukozy, która działa jako źródło energii, sprzyjając rozwojowi grzybów nad bakteriami. Całość zmieszana z agarem-agarem, składnikiem nadającym mu odpowiednią konsystencję..

Z drugiej strony agar Sabouraud z dekstrozą może być selektywny, jeśli doda się antybiotyki..

W przypadku antybiotyków jest szczególnie przydatny w próbkach ran, otwartych wrzodów lub wszelkich próbkach, w których podejrzewa się duże skażenie bakteryjne.

Najczęściej używane kombinacje agaru Sabouraud z dekstrozą i antybiotykami

-Agar Sabourauda z chloramfenikolem: idealny do odzyskiwania drożdży i grzybów strzępkowych.

-Agar Sabourauda z gentamycyną i chloramfenikolem: prawie wszystkie grzyby nitkowate i drożdże rosną na tym podłożu i hamują dużą liczbę bakterii, w tym Enterobacteriaceae, Pseudomonas i Staphylococcus.

-Agar Sabourauda z cykloheksymidem: jest szczególnie przydatny do próbek ze skóry lub dróg oddechowych, o ile podejrzewa się grzyby dymorficzne.

Należy zachować ostrożność podczas stosowania cykloheksymidu; Chociaż jest stosowany do hamowania wzrostu niepatogennych lub środowiskowych grzybów i drożdży, które mogą być obecne jako zanieczyszczenia w próbce, hamuje również wzrost niektórych grzybów, takich jak Cryptococcus neoformansAspergillus fumigatus, Allescheria boydii, Penicillium sp i inne grzyby oportunistyczne.

-Agar Sabourauda z chloramfenikolem i cykloheksymidem: stosowany głównie do izolacji dermatofitów i grzybów dimorficznych. Ma tę wadę, że hamuje niektóre gatunki grzybów oportunistycznych, np Candida no albicans, Aspergillus, Zygomycetes lub C.. neoformans.

-Agar Sabourauda z chloramfenikolem, streptomycyną, penicyliną G i cykloheksymidem: jest idealny do próbek skrajnie zanieczyszczonych bakteriami i grzybami saprofitycznymi, ale ma tę wadę, że hamuje wzrost Actinomyces i Nocardias, oprócz wymienionych powyżej grzybów oportunistycznych.

Przygotowanie

Jeśli masz składniki osobno, możesz je przygotować w następujący sposób:

Agar Sabouraud z dekstrozą 

Ważyć:

- 40 gr dekstrozy

- 10 g peptonu

- 15 gr agaru-agaru

- Odmierz 1000 ml wody destylowanej

Wszystkie składniki miesza się, pH ustawia się na 5,6. Substancje rozpuszczone rozpuszcza się przez gotowanie, 20 ml pożywki rozprowadza się w probówkach o wymiarach 25 x 150 mm, bez krawędzi i najlepiej z bawełnianą nasadką..

Rurki z bawełnianą nasadką. Źródło: Zdjęcie autorstwa mgr inż. Marielsa gil

W zależności od dostępności można również zastosować inne rozmiary rur.

Są autoklawowane przez 10 minut w atmosferze ciśnienia (121 ° C). Nie należy przekraczać czasu autoklawowania. Wychodząc z autoklawu, probówki są pochylane za pomocą wspornika, aż zestalą się w kształcie rowka..

Innym sposobem jest rozpuszczenie składników przez ogrzewanie do wrzenia. W tej samej kolbie autoklawować przez 10 minut, a następnie rozprowadzić 20 ml na szalkach Petriego..

Jeśli masz podłoże agarowe Sabouraud z dekstrozą, które zawiera już wszystkie składniki, zważ ilość określoną przez firmę handlową na jeden litr wody. Pozostałe kroki są takie same, jak te opisane powyżej.

Agar Sabouraud z dekstrozą (modyfikacja Emmonsa)

Ważyć:

-  20 gr dekstrozy

- 10 g peptonu

-  17 gr agaru-agaru

-  Odmierz 1000 ml wody destylowanej

Wszystkie składniki miesza się, pH ustawia się na 6,9. Postępuj analogicznie, jak w poprzednim przypadku.

Są domy komercyjne, które oferują pożywkę ze wszystkimi składnikami. W takim przypadku zważ i przygotuj zgodnie z opisem na wkładce..

Agar Sabouraud z dekstrozą (modyfikacja Emmonsa) z chloramfenikolem

Roztwór podstawowy chloramfenikolu

- Odważyć 500 mg zasady chloramfenikolu

- Odmierz 100 ml 95% etanolu

- Mieszać

Agar Sabouraud z dekstrozą (Emmons) przygotowuje się zgodnie z wcześniejszym opisem i dodatkowo na każdy litr podłoża dodaje się 10 ml roztworu podstawowego chloramfenikolu przed autoklawowaniem..

Agar dekstrozowy Sabourauda Emmonsa z cykloheksymidem

Roztwór podstawowy cykloheksymidu

- Odważyć 5 g cykloheksymidu

- Odmierz 100 ml acetonu

- Mieszać

Agar Sabouraud z dekstrozą (Emmons) przygotowuje się zgodnie z wcześniejszym opisem i dodatkowo na każdy litr podłoża dodaje się 10 ml roztworu podstawowego cykloheksymidu przed autoklawowaniem..

Agar Sabouraud z dekstrozą (Emmons) z chloramfenikolem i cykloheksymidem

Agar Sabouraud z dekstrozą (Emmons) przygotowuje się jak już opisano i dodatkowo na każdy litr pożywki dodać 10 ml roztworu podstawowego chloramfenikolu i 10 ml roztworu podstawowego cykloheksymidu przed autoklawowaniem..

Inne antybiotyki, które można dodać

20 000 do 60 000 jednostek penicyliny na litr podłoża.

30 mg streptomycyny na litr pożywki.

Obydwa muszą zostać wprowadzone po sterylizacji w autoklawie, lekko schłodzonej (50-55 ° C).

0,04 g neomycyny na litr pożywki.

0,04 g gentamycyny na litr podłoża.

Uwagi specjalne

Ze względów bezpieczeństwa lepiej jest wysiewać agar Sabouraud z dekstrozą w probówkach w kształcie klina (nachylonych dziobem w kształcie rowka) niż na szalkach Petriego, aby uniknąć rozpraszania i wdychania zarodników.

Ważne jest, aby probówki z agarem Sabourauda były pokryte bawełną, a nie zakrętką, ponieważ wykazano, że warunki półbeztlenowe hamują tworzenie zarodników u niektórych szczepów, na przykład Coccidioides immitis. Ponadto większość grzybów jest tlenowa..

W przypadku stosowania zakrętki nie zamykaj hermetycznie.

QA

Przygotowane pożywki powinny zostać poddane kontroli jakości w celu zweryfikowania ich prawidłowego działania. W tym celu wysiewa się pewne szczepy kontrolne.

Dla agaru Sabouraud z dekstrozą i chloramfenikolem, szczepy ATCC o Candida albicans, który musi mieć doskonały wzrost. Kolejną płytkę zaszczepiono szczepami Escherichia coli, musi być całkowicie zahamowany.

Inkubuje się również niezaszczepioną płytkę, na której nie powinny rosnąć żadne mikroorganizmy..

Dla agaru Sabouraud z dekstrozą z chloramfenikolem i cykloheksymidem, szczepy  Trichophyton mentagrophytes, powinien dobrze się rozwijać. Kolejną płytkę zaszczepiono szczepem Aspergillus flavus, w którym wzrost musi być niewielki lub żaden. Dodatkowo niezaszczepiona płytka jest inkubowana w celu wykazania jej sterylności..

Dla agaru Sabouraud z dekstrozą i cykloheksymidem, szczepy Candida albicans, Trichophyton rubrum  lub Microsporum canis, które muszą wykazywać dobry wzrost.

Podobnie, szczep Aspergillus flavus, wykazujący niewielki lub żaden wzrost. Na koniec inkubuj niezaszczepioną płytkę w celu kontroli sterylności..

Aplikacje

Kultura pierwotna

Klasyczny agar dekstrozowy Sabouraud zawiera 4 gramy dekstrozy i jest doskonały jako pierwotna pożywka izolacyjna, ponieważ wykazuje charakterystyczną morfologię każdego grzyba..

Doskonale nadaje się również do demonstrowania produkcji pigmentów. Jednak nie jest to najbardziej odpowiedni sposób obserwacji sporulacji..

Nie jest również polecany do uprawy Blastomyces dermatitidis, co jest hamowane przez wysokie stężenie obecnej glukozy.

Z drugiej strony w przypadku uprawy należy wziąć pod uwagę pewne kwestie.

Niektóre grzyby rosną najlepiej w temperaturze pokojowej, jak pleśnie, inne z powodzeniem rosną w 37 ° C, jak niektóre drożdże, a inne mogą rosnąć w obu temperaturach (grzyby dymorficzne).

Z tego powodu czasami konieczne jest użycie kilku płytek agarowych Sabourauda do tej samej próbki, ponieważ zduplikowane wysiewanie jest często wykonywane w celu inkubacji jednej płytki w temperaturze pokojowej, a drugiej w 37 ° C..

Na przykład, Sporothrix schenckii wysiewa się go na dwóch talerzach; jedną inkubuje się w temperaturze pokojowej w celu uzyskania fazy pleśni, a drugą w 37 ° C w celu uzyskania fazy drożdżowej, przy czym w drugiej konieczne jest dodanie 5% krwi do pożywki.

W innych przypadkach, takich jak próbki mycetoma, wysiewa się dwie płytki agarowe Sabourauda, ​​jedną chloramfenikolem, a drugą cykloheksymidem. Pierwsza z nich pozwoli na rozwój czynników wywołujących grzybicę pochodzenia grzybiczego (Eumycetoma), a druga sprawców grzybiczych pochodzenia bakteryjnego, takich jak promieniowce..

Sporulacja

Agar Sabouraud dekstrozowy zmodyfikowany przez Emmons zawiera 2 gramy dekstrozy i jest używany nie tylko do izolacji, ale także do sporulacji i konserwacji grzybów.

W tym medium, jeśli szczepy Blastomyces dermatitidis.

Ochrona

Aby zachować kultury grzybów, można je przechowywać w lodówce (2-8 ° C). Czas ochrony może wynosić od 2 do 8 tygodni. Po tym czasie należy je poddać podhodowli, aby powtórzyć proces..

Niektóre grzyby najlepiej przechowywać w temperaturze pokojowej, np Epidermophyton foccosum, Trichophyton schoenleinnii, T. violaceum Y Microsporum audounii.

Utrzymanie szczepu można wydłużyć, aby uniknąć pleomorfizmu, jeśli dekstroza zostanie całkowicie usunięta z agaru i jeśli ilość agaru w pożywce zostanie zmniejszona, aby uniknąć wysuszenia.

Mikrokultury

W celu identyfikacji niektórych grzybów strzępkowych konieczne jest wykonanie mikrokultur z użyciem agaru Sabourauda lub innych specjalnych środków do obserwacji struktur rozmnażania płciowego i bezpłciowego..

W mikologii człowieka

Służy głównie do diagnostyki chorób grzybiczych, zwłaszcza tych, które dotyczą skóry i jej przyczepów (włosów i paznokci).

Próbkami mogą być wydzieliny, wysięki, skóra, włosy, paznokcie, plwocina, płyn mózgowo-rdzeniowy lub mocz. Powszechnie izolowanymi patogenami są dermatofity, grzyby wywołujące grzybice podskórne i układowe..

Mikologia zwierząt

Zwierzęta są często dotknięte infekcjami grzybiczymi, dlatego agar Sabourauda jest równie przydatny w mikologii zwierząt, jak u ludzi..

Na przykład dermatofity mogą często atakować zwierzęta. Tak jest w przypadku Microsporum canis var distortum, Często zaraża psy, koty, konie, świnie i małpy. Również, Microsporum gypseum infekuje psy, koty i zwierzęta gospodarskie.

Wpływa na ptaki, takie jak kury, koguty i kury Microsporum gallinae.

Inne grzyby, takie jak Zymonema farciminosum, Są również przyczyną chorób zwierząt, głównie koni, mułów i osłów, powodując znaczne zapalenie naczyń limfatycznych..

Sporothrix schenkii i Histoplasma capsulatum wpływają na zwierzęta domowe i ludzi.

Mikologia środowiska

Wiele patogennych lub oportunistycznych grzybów może koncentrować się w dowolnym momencie w danym środowisku, szczególnie na salach operacyjnych i oddziałach intensywnej terapii (OIT) klinik i szpitali. Dlatego konieczne jest ich kontrolowanie.

Inne wrażliwe miejsca to biblioteki i stare budynki, na które może mieć wpływ koncentracja grzybów środowiskowych.

W badaniach środowiskowych do izolacji grzybów stosuje się agar Sabouraud z dekstrozą..

Mikologia przemysłowa

Agar dekstrozowy Sabourauda nie może być nieobecny do badania grzybów skażających przy produkcji m.in. kosmetyków, żywności, napojów, skór, tekstyliów..

Mikologia roślin

Rośliny cierpią również na choroby wywoływane przez grzyby, dotykające różne części rośliny, które mogą nawet zakończyć zbiory, powodując ogromne straty w rolnictwie..

Bibliografia

  1. Cuenca M, Gadea I, Martín E, Pemán J, Pontón J, Rodríguez (2006). Diagnostyka mikrobiologiczna grzybic i badania wrażliwości na leki przeciwgrzybicze. Zalecenia Hiszpańskiego Towarzystwa Chorób Zakaźnych i Mikrobiologii Klinicznej. Dostępne pod adresem: coesant-seimc.org
  2. Laboratorium ValteK. (2009). Agar Sabouraud z dekstrozą i cykloheksymidem. Dostępne pod adresem: andinamedica.com.
  3. Navarro O. (2013). Mikologia weterynaryjna. Narodowy Uniwersytet Rolniczy. Nikaragua.
  4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott Microbiological Diagnosis. 12 ed. Argentyna. Od redakcji Panamericana S.A
  5. Casas-Rincón G. General Mycology. 1994. Wydanie drugie, Central University of Venezuela, Library Editions. Wenezuela Caracas.

Jeszcze bez komentarzy