Podłoże, przygotowanie i zastosowanie agaru Thayer Martin

2431
Robert Johnston

Plik Agar Thayer Martin to bardzo pożywne i selektywne stałe podłoże do izolacji Neisseria meningitidis i Neisseria gonorrhoeae; obie znane jako patogenne lub klinicznie ważne Neisseria.

Jedną z najważniejszych cech szczególnych Thayer Martin Agar jest wysoka zawartość suplementów diety. Ta właściwość jest niezbędna, ponieważ Neisseria są mikroorganizmami bardzo wymagającymi z żywieniowego punktu widzenia i dlatego nie rosną w zwykłych pożywkach..

Medium biznesowe Thayer Martin / Agar Thayer Martin. Zdjęcie źródłowe 1: Wykonane przez autora mgr inż. Marielsa Gil, zdjęcie 2. Pixinio.com bakteriakolonizowany, modyfikowany, Thayer, Martin, agar.

Z drugiej strony, ponieważ mikroorganizmy te zwykle występują w obszarach niesterylnych, konieczne jest dodanie inhibitorów, które zapobiegają wzrostowi towarzyszącej flory, bez wpływu na rozwój rodzaju Neisseria..

Agar ten składa się z agaru podstawowego GC, hemoglobiny, dodatkowych suplementów diety i kompleksu substancji hamujących (antybiotyki i leki przeciwgrzybicze). Domy komercyjne sprzedają każdy z dodatków osobno.

Próbka, która ma być wysiana w tym podłożu, będzie zależała od poszukiwanego mikroorganizmu. W celu Neisseria gonorrhoeae idealne próbki to wydzielina z pochwy i cewki moczowej. Podczas gdy dla Neisseria meningitidis najczęściej używanymi próbkami są płyn mózgowo-rdzeniowy, wysięk z gardła i nosogardzieli.

Indeks artykułów

  • 1 Uzasadnienie
    • 1.1 Agar bazowy GC
    • 1.2 Hemoglobina
    • 1.3 Dodatek wzbogacający
    • 1.4 Inhibitory
  • 2 Przygotowanie
    • 2.1 Oryginalny agar Thayer Martin
    • 2.2 Zmodyfikowany agar Thayer Martin
  • 3 Użyj
  • 4 Kontrola jakości
  • 5 Ograniczenia
  • 6 Odnośniki

Podstawa

Neisserias to mikroorganizmy klasyfikowane jako uciążliwe i dlatego ich izolacja jest trudna. Z tego powodu Thayer Martín jest złożonym medium, a każdy z jego składników spełnia funkcję wyjaśnioną poniżej:

Agar bazowy GC

Agar GC zawiera pepton proteozowy, skrobię kukurydzianą, chlorek sodu, fosforan dipotasowy, fosforan monopotasowy i agar-agar. Jego składniki dostarczają podstawowych składników odżywczych dla rozwoju mikroorganizmów, neutralizują toksyczne kwasy tłuszczowe, pomagają utrzymać równowagę osmotyczną, definiują pH i zapewniają stałą konsystencję pożywce..

Hemoglobina

Hemoglobina dostarcza czynniki V i X (odpowiednio dinukleotyd nikotynamidoadeninowy NAD i hemina). Z tego powodu gatunki Haemophilus również rosną w tym podłożu. Hemoglobinę można uzyskać w handlu w postaci odwodnionej lub do pożywki można dodać świeżą odwłóknioną krew bydlęcą..

Dodatek wzbogacający

Z drugiej strony do pożywki Thayer-Martin należy dodać także dodatek wzbogacający, ponieważ składniki odżywcze zawarte w podstawowym agarze nie są wystarczające dla potrzeb rodzaju Neisseria..

Najczęściej stosowanym suplementem wzbogacającym jest isovitalex. Zawiera glutaminę, adeninę, NAD, kokarboksylazę, guaninę, azotan żelaza, kwas p-aminobenzoesowy, witaminę B12, tiaminę i glukozę. Wszystkie te związki są niezbędne do prawidłowego rozwoju chorobotwórczych Neisserias.

Inhibitory

Ponieważ jest to pożywka o wysokiej wartości odżywczej, należy stosować inhibitory, które zapobiegają rozwojowi mikroorganizmów typowej flory obszaru, a tym samym sprzyjają izolacji rodzaju Neisseria..

Kompleks inhibitorów składa się z wankomycyny, kolistyny ​​i nystatyny. Wankomycyna hamuje wzrost bakterii Gram-dodatnich, kolistyna zapobiega rozwojowi bakterii Gram-ujemnych, takich jak Pseudomonas i niektóre saprofityczne Neisserias, a nystatyna działa na drożdże jako Candida albicans.

Jednak agar Thayer Martin został później zmodyfikowany; zmiany polegały na dodaniu trimetoprimu, zwiększeniu ilości agaru i dodaniu dodatkowej glukozy. Zmiany te znacznie poprawiły regenerację gatunku Neisseria gonorrhoeae.

Należy zauważyć, że trimetoprim hamuje wzrost rodzaju Proteus i wynikające z niego rojenie. W tym sensie antybiotyki to te, które zapewniają selektywny charakter pożywce Thayer Martin.

Przygotowanie

Oryginalny agar Thayer Martin

-Agar GC

Odważyć 8,2 g odwodnionej pożywki GC i zawiesić w 100 ml. Mieszaj i gotuj przez 1 minutę, często mieszając, aż do całkowitego rozpuszczenia. Sterylizuj mieszaninę w autoklawie w 121 ° C przez 15 minut.

-2% hemoglobiny

Zawiesić 2 g odwodnionej hemoglobiny w 2 lub 3 ml gorącej wody destylowanej do uzyskania jednorodnej mieszaniny. Dodawaj stopniowo więcej wody, aby uzyskać objętość 100 ml. Zawiesina musi być jednorodna przed sterylizacją.

Sterylizuj w autoklawie przez 15 minut.

-Dodatek wzbogacający

Rekonstytuować handlową fiolkę rozcieńczalnikiem dostarczonym przez tę samą firmę handlową. Dobrze wymieszaj. Ilość używanego rozcieńczalnika zostanie podana w instrukcji zestawu..

-Suplement hamujący V.C.N (wankomycyna, kolistyna, nystatyna)

Zrekonstytuować fiolkę rozcieńczalnikiem dostarczonym przez firmę handlową. Dobrze wymieszaj. Ilość używanego rozcieńczalnika zostanie podana w instrukcji zestawu..

-Przygotowany

Na każde 100 ml agaru GC należy postępować w następujący sposób:

Gdy agar GC opuści autoklaw, pozostaw go do ostygnięcia do temperatury około 50 ° C i dodaj 2 ml przygotowanego roztworu hemoglobiny, 2 ml suplementu wzbogacającego (isobitalex lub britalex) i 2 ml suplementu hamującego. Wymieszaj i podawaj na sterylnych szalkach Petriego..

Pozostawić do zestalenia i przechowywać w lodówce do czasu użycia.

Kolor przygotowanego podłoża to wiśniowy. Końcowe pH pożywki wynosi 7,2 ± 0,2

Zmodyfikowany agar Thayer Martin

Odważyć 8,2 g odwodnionej pożywki GC i zawiesić w 100 ml. Dodaj 1 g agaru i 0,3 g glukozy. Mieszaj i gotuj przez 1 minutę, często mieszając, aż do całkowitego rozpuszczenia. Sterylizuj mieszaninę w autoklawie w 121 ° C przez 15 minut.

Przygotuj hemoglobinę i suplement wzbogacający, jak opisano powyżej.

Stosowanym suplementem hamującym jest V.C.N.T (wankomycyna, kolistyna, nystatyna, trimetoprim).

-Przygotowany

Postępuj zgodnie z opisem dla oryginalnego agaru Thayer Martin.

Posługiwać się

Thayer Martin Agar należy pozostawić do ogrzania, zanim okazy zostaną pokryte pasmami. Powszechnie używanymi próbkami są wymazy z gardła, wymazy z nosa, wydzielina z pochwy, cewki moczowej i / lub odbytu oraz płyn mózgowo-rdzeniowy..

Użyj świeżych próbek i zrób mocne inokulum na agarze. Próbki wysiewa się bezpośrednio przez wyładowanie materiału, a następnie smugi zubożające na powierzchni.

Płytki są inkubowane w temperaturze 35-37 ° C przez 24 do 48 godzin w mikroaerofilnym słoju (5% COdwa). Pod koniec okresu inkubacji płytki bada się pod kątem małych kolonii, szarych, a czasem śluzowatych..

Wykonaj Gram i potwierdzające testy biochemiczne na podejrzanych koloniach.

QA

Do kontroli jakości na podłożu Thayer Martin Agar można zastosować następujące szczepy drobnoustrojów.

Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226 i Neisseria meningitidis ATCC 13090; oczekuje się zadowalającego rozwoju obu szczepów.

Należy również uwzględnić następujące szczepy: Staphylococcus epidermidis ATCC 14990, Escherichia coli ATCC 25922, Proteus mirabilis ATCC 43071 i Candida albicans ATCC 10231. We wszystkich z nich oczekuje się całkowitego lub częściowego hamowania w tej pożywce..

Ograniczenia

-Należy pamiętać, że w pożywce mogą rosnąć bakterie odporne na zastosowane inhibitory.

-Istnieją szczepy Neisseria gonorrhoeae które mogą być wrażliwe na stężenie zastosowanej wankomycyny. Z tego powodu zaleca się stosowanie agaru czekoladowego z dodatkiem izowitalexu, ale bez inhibitorów..

-Istnieją szczepy drożdży oporne na nystatynę, które mogą rosnąć w tym podłożu i przeszkadzać w izolacji patogennych Neisseria, zwłaszcza gonokoków..

Bibliografia

  1. Laboratoria diagnostyczne Valtek. Agar Thayer-Martin.2016. Dostępne pod adresem: com
  2. Britannia Laboratories. Thayer Martin Medium zmodyfikowano. 2010 Dostępne pod adresem: britanialab.com
  3. Współtwórcy Wikipedii. Agar Thayer-Martin. Wikipedia, wolna encyklopedia. 26 października 2017, 16:33 UTC. Dostępne pod adresem: wikipedia.org 4. Dostęp 28 lutego 2019 r.
  4. Britannia Laboratories. Agar GC. 2010 Dostępne pod adresem: britanialab.com.
  5. Laboratoria BBL ™ Medium Enrichment dla wybrednych mikroorganizmów. 1999. Dostępne w: bd.com
  6. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnoza mikrobiologiczna Bailey & Scott. 12 ed. Od redakcji Panamericana S.A. Argentyna.

Jeszcze bez komentarzy