Plik Pożywka Löwenstein-Jensen to selektywne stałe podłoże do izolacji i rozwoju bakterii z rodzaju Mycobacterium, takich jak Prątek gruźlicy, M. avium, między innymi z wyjątkiem gatunku leprae, który nie jest uprawiany.
Bakterie z rodzaju Mycobacterium nie rosną w konwencjonalnych pożywkach hodowlanych, dlatego konieczne było zaprojektowanie specjalnego podłoża do ich izolacji. Oryginalne medium zostało stworzone przez Löwensteina, a później zmodyfikowane przez Jensena.
Modyfikacja polegała na wyeliminowaniu czerwonego barwnika Kongo, zastępując go wyższym stężeniem zieleni malachitowej. Zmienił również stężenia cytrynianu magnezu i fosforanu monopotasu.
Pożywka Löwenstein-Jensen zawiera obecnie skrobię ziemniaczaną, asparaginę, cytrynian magnezu, fosforan monopotasu, siarczan magnezu, zieleń malachitową, kwas nalidyksowy, cykloheksymid, linkomycynę, roztrzepane jajka, glicerynę i wodę..
Mykobakterie są zwykle izolowane z miejsc, które nie są sterylne, takich jak między innymi plwocina, mocz, ropnie. Oznacza to, że większość próbek będzie zawierała zwykłą mikrobiotę danego obszaru oraz patogen..
Dlatego pożywka Löwenstein-Jensen zawiera w swoim składzie szereg inhibitorów reprezentowanych przez zieleń malachitową, antybiotyki i leki przeciwgrzybicze..
Ponadto próbki pochodzące z miejsc niesterylnych muszą zostać odkażone i zneutralizowane przed wysianiem na pożywkę Löwenstein-Jensen.
Indeks artykułów
Obecność jaja i gliceryny w pożywce Löwenstein-Jensen stymuluje wzrost prątków, ponieważ dostarczają kwasów tłuszczowych i białek niezbędnych do rozwoju tych mikroorganizmów..
Pożywka Löwenstein-Jensen zawiera zieleń malachitową, która jest inhibitorem towarzyszącej mikrobioty. Ale zawiera również kwas nalidyksowy (35 µg / ml), który hamuje mikroflorę Gram-ujemną, cykloheksymid (400 µg / ml), który hamuje rozwój grzybów saprofitycznych i drożdżaków, oraz linkomycynę (2 µ / ml), która hamuje mikroflorę Gram-dodatnią.
Niektóre firmy komercyjne wolą dodawać następującą kombinację antybiotyków: polimyksyna B 200 000 jednostek / l, amfoterycyna B 10 mg / l, karbenicylina 50 mg / l i trimetoprim 10 mg / l.
To podłoże nie zawiera agaru, dlatego krzepnięcie podłoża następuje w wyniku koagulacji albuminy obecnej w jaju podczas sterylizacji..
Odważyć 37,3 g odwodnionej pożywki w 600 ml wody destylowanej, do której wcześniej dodano 12 ml glicerolu. Mieszaninę ogrzewa się, często mieszając, aż do całkowitego rozpuszczenia. Autoklawuj pożywkę w 121 ° C przez 15 minut.
Z drugiej strony w warunkach aseptycznych należy przygotować jednorodną zawiesinę 1000 ml świeżych jaj. Do 600 ml przygotowanej pożywki dodać zawiesinę jajeczną w temperaturze 50 - 60 ° C, unikając pęcherzyków powietrza.
Roztwory antybiotyków są również dodawane po autoklawowaniu..
Wlej pożywkę do jałowych probówek z zakrętkami. Ogrzewać probówki w temperaturze 85 ° C przez 45 minut w pozycji pochylonej..
Kolor przygotowanej pożywki jest seledynowo zielony i może mieć białawe plamy ze względu na obecność lipidów jaja..
PH pożywki musi wynosić 7,2 ± 0,2
Do czasu użycia przechowywać probówki w lodówce i chronić przed bezpośrednim światłem. Odpuszczać przed siewem.
Istnieje modyfikacja medium o nazwie „Gruft modyfikacja Löwenstein Jensen”. Zawiera te same związki co klasyczne podłoże, ale dodaje się RNA-5 mg / 100 ml, a jako inhibitory zawiera zieleń malachitową 0,025 g / 100 ml, penicylinę 50 U / ml i kwas nalidyksowy 35 ug / ml..
Pożywka Löwenstein-Jensen służy do izolacji prątków z różnych typów próbek. Barwienie Ziehl-Neelsen jest zalecane dla każdej próbki, w której podejrzewa się obecność prątków..
Niektóre próbki pochodzą z miejsc sterylnych, a inne nie. Próbki niesterylne należy odpowiednio odkazić:
Próbki plwociny należy odkazić w następujący sposób: określić ilość próbki plwociny w ml i dodać taką samą ilość 4% NaOH do próbki i inkubować w 37 ° C.
Często wstrząsaj mieszanką przez 30 minut. Następnie wirować przy 3000 RPM przez 30 minut.
Wyrzucić supernatant na fenolowy roztwór dezynfekujący. Użyć osadu do siewu, ale najpierw należy zneutralizować pH.
Aby zneutralizować osad, H.dwapołudniowy zachód4 5% w obecności wskaźnika czerwieni fenolowej, aż do osiągnięcia neutralnego pH dającego kolor łososiowy.
W takim przypadku próbkę należy odwirować przy 3000 obr./min przez 30 minut. Supernatant odrzuca się i stosuje się osad. Aby odkazić osad, dodać 3 ml 4% NaOH i często mieszać w temperaturze 37 ° C przez pół godziny..
Ponownie odwirować, supernatant jest odrzucany, a osad jest używany. Ten ostatni należy zneutralizować, jak wyjaśniono w próbce plwociny..
Pozostaw próbkę do osadzenia w lodówce na 24 godziny. Oddziel supernatant. Pozostały osad należy wirować przez 30 minut przy 3000 obr / min. Ponownie wyrzucić supernatant i odtworzyć osad 3 ml sterylnego roztworu fizjologicznego..
Dodać 3 ml 4% NaOH i przystąpić do odkażania i neutralizacji zgodnie z wcześniejszym opisem..
W przypadku tego typu próbki odwirowuje się, a supernatant odrzuca. Wykonaj Grama na osadzie lub obserwuj bezpośrednio pod mikroskopem; Jeśli nie obserwuje się bakterii, etap odkażania nie jest konieczny, podobnie jak etap neutralizacji.
W takim przypadku próbkę można wysiać bezpośrednio z osadu. Jeśli są bakterie, przystąp do odkażania i neutralizacji, jak opisano powyżej..
Do tego typu próbki należy dodać 5 ml wody destylowanej w celu późniejszego odwirowania przy 1500 obr./min przez 10 minut. Odrzucić supernatant i ponownie odwirować osad przy 3500 RPM przez 30 minut. Użyj osadu do wysiania pożywki hodowlanej.
Wymazówkę należy umieścić w sterylnej probówce zawierającej równe części wody destylowanej i 4% NaOH. Wymazówkę należy przycisnąć do ścianek probówki, tak aby próbka została rozcieńczona w płynie. Odwirować i użyć osadu. Zneutralizuj osad, jak już opisano.
Pożywkę Löwenstein-Jensen zaszczepia się, dodając 0,5 ml próbki na powierzchnię pożywki. Obróć probówkę, aby rozprowadzić próbkę w podłożu. Nie używaj platynowego uchwytu.
W celu izolacji można posiać drugą probówkę zawierającą pożywkę Stonebrink Mycobacterium bovis i inne gatunki, które nie rosną na pożywce Löwenstein-Jensen.
Zaszczepione probówki inkubuje się w warunkach tlenowych w 37 ° C, z lekko luźną zakrętką, nachyloną pod kątem około 5 ° i chronioną przed światłem. Środowisko można wzbogacić 5-10% dwutlenkiem węgla. Sprawdzaj kultury dwa razy w tygodniu, aż pojawią się kolonie.
Po wchłonięciu próbki nakrętki są dokręcane. Maksymalny czas inkubacji wynosi 8 tygodni, jeśli po tym czasie nie ma wzrostu, jest on zgłaszany jako ujemny.
Do kontroli jakości można użyć następujących szczepów:
Prątek gruźlicy ATCC 27294, Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Cryptococcus neoformans ATCC 32045
Oczekuje się doskonałego rozwoju dla pierwszych trzech wymienionych gatunków, np M. fortuitum wzrost musi być dobry, podczas gdy dla M. bovis oczekuje się niewielkiego lub żadnego wzrostu. Natomiast gatunki inne niż rodzaj Mycobacterium muszą być całkowicie zahamowane.
Przygotowane podłoże należy chronić przed światłem, długotrwałe działanie światła powoduje zmianę jego koloru z zielonego na niebieski, w takim przypadku nie można go już używać. Dzieje się tak, ponieważ zieleń malachitowa jest światłoczuła..
Pożywka, ponieważ zawiera jajka, może być łatwo zanieczyszczona, jeśli nie jest traktowana aseptycznie. Może być rozpuszczony, jeśli jest zanieczyszczony bakteriami proteolitycznymi.
Hodowla i obchodzenie się z bakteriami z rodzaju Mycobacterium wymaga wykwalifikowanego personelu, który jest świadomy środków bezpieczeństwa biologicznego, których należy przestrzegać, aby uniknąć zakażenia lub zakażenia innych..
HCl nie powinien być używany na etapie neutralizacji ze względu na tworzenie się chlorku sodu, który może być toksyczny dla Bacillus Kocha..
Próbki należy przechowywać w lodówce i chronić przed światłem, gdy nie są przetwarzane..
Jeszcze bez komentarzy