Plik barwienie hematoksyliną i eozyną to technika barwienia wykorzystująca połączenie barwników hematoksyliny i eozyny. Ta para barwników tworzy doskonały duet, ponieważ hematoksylina działa jako barwnik zasadowy, a eozyna jest barwnikiem kwasowym..
Oznaczenie barwników zasadowych lub kwasowych nie odnosi się do pH, które uzyskują w roztworze, ale raczej mówi o przeważającej proporcji pod względem posiadanych ładunków anionowych lub kationowych lub lokalizacji grupy chromoforowej..
W tym sensie hematoksylinę uważa się za barwnik zasadowy (kationowy) i dlatego wykazuje powinowactwo do struktur kwasowych, takich jak jądro komórkowe. Podczas gdy eozyna, będąc barwnikiem kwasowym (anionowym), ma powinowactwo do struktur zasadowych lub zasadowych, takich jak cytoplazma komórki.
Z tego powodu ta kombinacja barwników jest szeroko stosowana do barwienia tkanek, ponieważ umożliwia wyraźne rozróżnienie jąder i cytoplazmy. Jądra wybarwiają się na ciemnoniebiesko lub fioletowo i cytoplazmatycznie różowo.
Barwienie hematoksyliną i eozyną jest jedną z najczęściej stosowanych technik barwienia w dziedzinie histologii i cytologii, ze względu na łatwą obsługę i niski koszt. Służy do wizualizacji komórek, grubych włókien nerwowych oraz obecności w tkankach określonych mikroorganizmów, takich jak m.in .: pasożyty, grzyby i bakterie..
Indeks artykułów
Hematoksylina jest barwnikiem neutralnym. Jednak składnik zapewniający kolor (chromofor) znajduje się w kationowym lub zasadowym centrum cząsteczki. Stąd jego powinowactwo do struktur kwasowych. Jego wzór chemiczny to C.16H.14LUB6 i jego nazwa naukowa 7,11b-dihydroindeno [2,1-do] chromene-3, 4,6a, 9,10 (6H.) -pentol.
Barwi głównie jądra komórek, ponieważ są one bardzo bogate w kwasy nukleinowe. Może również barwić wtrącenia cytoplazmatyczne pochodzenia wirusowego.
Aby hematoksylina zabarwiła się, musi być utleniona i związana z metalem. Ten ostatni będzie służył do mocowania do tkanki, to znaczy będzie działał jak zjadacz.
Utleniona hematoksylina nazywana jest hemateiną. Utlenianie następuje poprzez wystawienie na działanie tlenu (starzenie) odczynnika lub przez substancje, które wspomagają jego utlenianie (utlenianie chemiczne).
Eozyna to barwnik barwiący na czerwono lub różowo. Jest nierozpuszczalny w wodzie, chociaż istnieje wersja rozpuszczalna w wodzie. Ogólnie eozyna jest przygotowywana przez rozpuszczenie w alkoholu (95 ° etanol).
Barwi cytoplazmy, włókna mięśniowe, organelle cytoplazmatyczne i kolagen, ale nie plami jąder komórkowych. Dzieje się tak, ponieważ jest naładowany ujemnie, a zatem ma powinowactwo do struktur naładowanych dodatnio..
Istnieją dwa rodzaje eozyny „Y” i „B”. Eozyna „Y” jest znana jako żółta eozyna. Jego nazwa naukowa to tetrabromo-fluoresceina, a wzór chemiczny to C.dwadzieściaH.8Br4LUB5.
Z drugiej strony eozyna „B” jest czasami nazywana niebieskawą erytrozyną B. Jego nazwa naukowa to dibromodinitro-uoresceina, a wzór to CdwadzieściaH.8BrdwaNdwaLUB9. Oba są bardzo podobne, a różnica między używaniem jednego lub drugiego nie jest tak naprawdę zauważalna. Jednak najpopularniejsza jest eozyna „Y”.
Eozyna ma właściwość rozróżniania między żywą a martwą komórką, ponieważ jest w stanie przedostać się przez błonę, aby zabarwić jej cytoplazmę tylko wtedy, gdy komórki są martwe, pozostawiając cytoplazmę komórki bezbarwną, jeśli pozostaje żywa.
Dzięki hematoksylinie-eozynie można zabarwić i zidentyfikować grube włókna nerwowe. Jednak nie jest to przydatne do barwienia cienkich włókien nerwowych, ponieważ do ich uwidocznienia wymagane jest zabarwienie srebrem..
W barwieniu zrogowaciałej warstwy skóry działającym barwnikiem jest eozyna, ponieważ na tym poziomie komórki nie mają jądra.
W ziarnistej warstwie skóry hematoksylina silnie zabarwia granulki keratohialiny wewnątrz komórek ziarnistych. Wręcz przeciwnie, kolczasta warstwa skóry jest słabo zabarwiona hematoksyliną, podczas gdy warstwa podstawna lub zarodkowa jest wystarczająco zabarwiona.
Eozyna zabarwia cytoplazmę wszystkich komórek, a intensywność koloru może się różnić w zależności od warstwy..
Gómez i wsp., W 2005 roku wykazali, że barwienie hematoksyliną-eozyną jest bardziej skuteczne w identyfikowaniu przypadków pełzakowicy wywołanej Entamoeba histolytica Y Entamoeba dispar niż metoda świeżej wizualizacji (sól fizjologiczna i lugol) u pacjentów z ostrą biegunką.
Wykazano również, że jest bardzo wrażliwy na wykrywanie erytrofagocytozy (ameby, które pochłonęły erytrocyty).
Walwyn i wsp., W 2004 roku zaproponowali zastosowanie barwienia histologicznego do wykrywania drobnoustrojów infekcyjnych.
Używając barwienia hematoksyliną-eozyną, byli w stanie zwizualizować infekcje wywołane przez Clostridium, Actinomyces, spirillae lub Candida. Udało im się również zaobserwować obecność pasożyta Sarcoptes escabiei w skrawkach skóry i inkluzjach wirusowych przez wirusa cytomegalii i opryszczkę w skrawkach różnych tkanek.
Barwienie skrawków histologicznych przebiega w kilku etapach. Pierwszą rzeczą jest uzyskanie sekcji histologicznej. Należy to woskować, aby później uzyskać nacięcia (ultradrobne) za pomocą mikrotomu. Technika składa się z następujących kroków:
1-Eliminacja nadmiaru parafiny: w tym celu możesz użyć ksylolu lub Heme-D, zanurzyć na 3-5 minut.
2-Rehydracja próbki: Odbywa się to poprzez zanurzenie próbki w różnych stężeniach alkoholi (etanolu) w porządku malejącym (100 °, 90 °, 70 °). We wszystkich przypadkach przez 7 minut.
3-Eliminacja nadmiaru alkoholu: w tym celu zanurza się go w wodzie na 7 minut.
4-Barwienie hematoksyliną: próbkę zanurza się na 6–10 minut w tacy zawierającej hematoksylinę. Czas ekspozycji zależy od wielkości i grubości próbki..
5-Eliminacja nadmiaru hematoksyliny: Myje się wodą przez 5 minut, a następnie przeprowadza się szybkie przejście (10-20 sekund) przez kwaśny alkohol. Później ponownie myje się wodą przez 5 minut. Następnie zanurza się go w etanolu w temperaturze 96 ° na 1 minutę.
6-Barwienie eozyną: w tym celu próbkę zanurza się na 5 minut w tacce z eozyną.
7-Odwodnienie próbki: w tym celu tace z alkoholem (etanolem) są ponownie przepuszczane, ale tym razem w kolejności rosnącej. (70 °, 90 °, 100 °). (Odpowiednio przez 5 sekund, 5 sekund, 1 minutę).
8-Wyjaśnienie próbki: w tym celu jest wystawiany na działanie ksylolu przez 5-10 minut i suszony w celu trwałego uszczelnienia balsamem kanadyjskim lub innym podobnym materiałem.
Wykonywany jest rozmaz ze stolcem pacjenta na szkiełku i utrwalany 80% alkoholem przez 5 minut. Arkusz zanurza się w hematoksylinie na 5 minut i natychmiast przemywa wodą..
Następnie szybko zanurza się go w kwaśnym alkoholu, a następnie w wodzie amoniakalnej. Jest myty wodą. Jest barwiony przez 5 minut w eozynie. Próbkę odwadnia się, jak wyjaśniono w stanie techniki, a na koniec przemywa się ksylenem.
W jednym litrze wody destylowanej rozpuść 50 gramów siarczanu glinowo-potasowego lub amonowo-glinowego. Po całkowitym rozpuszczeniu dodać 1 gram wykrystalizowanej hematoksyliny. Po całkowitym rozpuszczeniu dodaje się 1 g kwasu cytrynowego razem z 50 g wodzianu chloralu i 0,2 g jodanu sodu..
Mieszaninę gotuje się przez 5 minut, a następnie pozostawia do ostygnięcia i filtruje w celu usunięcia wszelkich pozostałych cząstek stałych. Tak przygotowany odczynnik może być użyty natychmiast.
Można go przygotować na bazie alkoholu lub na bazie wody.
W 100 ml etanolu w temperaturze 95 ° rozpuść 0,5 grama eozyny „Y”. Następnie dodaj kilka kropli lodowatego kwasu octowego.
W 1250 ml wody destylowanej rozpuść 25 gramów rozpuszczalnej w wodzie eozyny „Y”. Następnie dodaj kilka kropli lodowatego kwasu octowego.
Odmierzyć 0,5 ml stężonego kwasu solnego i dopełnić do 100 ml alkoholem absolutnym.
Odmierz 0,5 ml stężonego amoniaku i uzupełnij do 100 ml wodą destylowaną.
Jeszcze bez komentarzy