Plik Agar cytrynianowy Simmonsa Jest to podłoże stałe używane jako test biochemiczny do identyfikacji mikroorganizmów, zwłaszcza pałeczek Gram-ujemnych. Oryginalne medium zostało stworzone przez Kosera w 1923 roku.
Podłoże Koser Citrate składało się z bulionu zawierającego fosforan sodu, fosforan amonu, fosforan monopotasu, siarczan magnezu i cytrynian sodu..
Jak widać, jedynym źródłem węgla w pożywce jest cytrynian, a azotu fosforan amonu, pomijając białka i węglowodany jako źródło tych pierwiastków, są one powszechnie obecne w innych pożywkach..
Dlatego bakterie zaszczepione w tym podłożu mogą rozmnażać się tylko wtedy, gdy są zdolne do pobierania węgla z cytrynianu. Test był pozytywny, jeśli w ośrodku było zmętnienie, jednak miał tę wadę, że mogło wystąpić niespecyficzne zmętnienie.
Simmons rozwiązał ten problem, dodając błękit bromotymolowy i agar do oryginalnej receptury Kosera. Chociaż zasada jest taka sama, jest różnie interpretowana.
Indeks artykułów
Niektóre bakterie mają zdolność przetrwania przy braku fermentacji lub produkcji kwasu mlekowego, wymagając pozyskiwania energii z innych substratów. W tym teście jedynym oferowanym źródłem węgla jest cytrynian.
Bakterie, które są zdolne do przetrwania w tych warunkach, szybko metabolizują cytrynian alternatywną drogą do tradycyjnej, wykorzystując cykl kwasu trikarboksylowego lub cykl fermentacji cytrynianu..
Katabolizm cytrynianu przez bakterie obejmuje mechanizm enzymatyczny bez udziału koenzymu A. Enzym ten jest znany pod nazwą cytrynian (liaza cytrynianowo-szczawiooctanowa) lub desmolaza cytrynianowa. Reakcja wymaga obecności dwuwartościowego kationu, który w tym przypadku jest dostarczany przez magnez.
W wyniku reakcji powstaje szczawiooctan i pirogronian, które następnie powodują powstanie kwasów organicznych w środku zasadowego pH utworzonego przy użyciu źródła azotu. Te kwasy organiczne są wykorzystywane jako źródło węgla, które generuje węglany i wodorowęglany, co dodatkowo alkalizuje środowisko..
Pożywkę cytrynianową Simmonsa należy lekko zaszczepić w fishtail za pomocą prostej pętli lub igły i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 35-37 ° C. Po pewnym czasie wyniki są obserwowane.
Wysiew odbywa się tylko na powierzchni agaru. Nie przebijaj.
Jeśli podłoże zachowuje oryginalny kolor (zielony) i nie ma widocznego wzrostu, wynik testu jest negatywny, ale jeśli podłoże zmieni kolor na niebieski, oznacza to obecność produktów alkalicznych, co jest wykrywane przez wskaźnik pH. W tym przypadku wynik testu jest pozytywny.
Dzieje się tak, ponieważ jeśli bakteria wykorzystuje węgiel z cytrynianu, jest również zdolna do pobierania azotu z fosforanu amonu, z którym uwalnia amoniak, alkalizując pożywkę..
Z drugiej strony, jeśli obserwuje się wzrost bakterii w pożywce, ale nie ma zmiany koloru, test również należy uznać za pozytywny, ponieważ jeśli nastąpił wzrost, oznacza to, że bakterie były w stanie wykorzystać cytrynian jako źródło węgla , nawet jeśli w tej chwili nie ma zmiany pH (czasami może to zająć trochę czasu).
Jeśli istnieją jakiekolwiek wątpliwości co do interpretacji ostatecznego koloru, można go porównać z niezaszczepioną probówką z cytrynianem.
Odważyć 24,2 g odwodnionej pożywki na 1 litr wody. Wymieszaj i odstaw na około 5 minut. Zakończyć rozpuszczanie medium przez podgrzewanie przez 1 lub dwie minuty, często wstrząsając.
Wlać 4 ml do probówek i autoklawować w 121 ° C przez 15 minut. Wychodząc z autoklawu, przechylić za pomocą podpórki w taki sposób, aby agar zestalił się w kształcie dzioba z niewielkim klockiem lub dnem i bardziej skośnym.
Końcowe pH pożywki cytrynianowej wynosi 6,9 (kolor zielony). To podłoże jest bardzo wrażliwe na zmiany pH.
Przy pH 6 lub niższym podłoże zmienia kolor na żółty. Ten kolor nie jest obserwowany w teście z bakteriami.
Przy pH 7,6 lub wyższym pożywka zmienia kolor na głęboki pruski niebieski kolor..
Simmons Citrate Agar jest używany do identyfikacji niektórych mikroorganizmów, zwłaszcza pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae i innych prątków niefermentujących glukozy.
Pożywka cytrynianowa Simmonsa jest bardzo delikatnym testem, ponieważ w przypadku popełnienia pewnych błędów można uzyskać fałszywie dodatnie wyniki..
Należy zachować następujące środki ostrożności:
Nie należy wykonywać bardzo gęstego lub obciążonego inokulum bakteryjnego, ponieważ może to spowodować pojawienie się miedziano-żółtego koloru w miejscu sadzenia, bez wpływu na resztę podłoża, ale może prowadzić do przekonania, że nastąpił wzrost. Nie oznacza to pozytywnego wyniku testu.
Podobnie gruby inokulum może generować fałszywie dodatni wynik, ponieważ wstępnie uformowane związki organiczne w ścianach komórkowych umierających bakterii mogą uwalniać wystarczającą ilość węgla i azotu, aby zmienić wskaźnik pH..
Dlatego najlepiej jest wysiewać przy użyciu igły zamiast platynowego uchwytu, aby uniknąć pobierania nadmiaru materiału.
Z drugiej strony, gdy wysiewa się baterię testów biochemicznych w celu identyfikacji danego mikroorganizmu, ważne jest, aby jako pierwszy zaszczepić test cytrynianowy, aby uniknąć przeniesienia białek lub węglowodanów z innej pożywki. ..
W tej sytuacji możliwe jest uzyskanie fałszywie dodatniego wyniku, ponieważ każda z tych substancji, która zostanie wprowadzona przez pomyłkę, zostanie zmetabolizowana i spowoduje zmianę pH..
Innym sposobem uniknięcia przenoszenia substancji jest dobre wypalenie pętli i pobranie nowego inokulum między jednym a drugim testem..
Należy również zachować ostrożność podczas dotykania kolonii w celu wykonania inokulum, ponieważ należy unikać wyciągania części agaru z kultury, z której pochodzą bakterie, ze względu na powyższe wyjaśnienia..
W tym sensie Matsen, Sherris i Branson zalecają rozcieńczenie inokulum w roztworze fizjologicznym przed zaszczepieniem testu cytrynianowego, aby uniknąć przenoszenia innych źródeł węgla..
Należy wziąć pod uwagę, że intensywność koloru uzyskanego po pozytywnym wyniku testu może się różnić w zależności od domu handlowego.
Ponadto istnieją mikroorganizmy, które dają wynik pozytywny po 24 godzinach, ale są też inne szczepy, które wymagają 48 godzin lub więcej, aby wywołać zmianę pH..
Jeszcze bez komentarzy