Plik agar standardowa liczba Jest to stałe, nieselektywne podłoże hodowlane przeznaczone do ilościowego określania tlenowego obciążenia drobnoustrojami obecnego m.in. w próbkach wody pitnej, ścieków, napojów mlecznych i innych produktów spożywczych. Podłoże to jest również znane jako agar PCA, ze względu na akronim w angielskim Plate Count Agar. Został założony w 1953 roku przez Buchbindera, Barisa i Goldsteina.
Standardowe podłoże agarowe składa się z ekstraktu drożdżowego, tripteiny, glukozy, agaru i wody destylowanej. Preparat zawiera podstawowe składniki odżywcze, które pozwalają na rozwój obecnego tlenowego obciążenia drobnoustrojami, nie wymagającego.
Ponieważ podłoże nie zawiera inhibitorów, bakterie mogą rosnąć bez żadnych ograniczeń, co czyni je idealnym do ogólnego liczenia kolonii. Jednak technika oznaczania ilościowego na płytkach nie wykryje wszystkich obecnych bakterii, a jedynie te, które są zdolne do wzrostu w warunkach środowiskowych, którym poddawany jest posiany agar z liczeniem standardowym..
W tym sensie technika ilościowego oznaczania płytek zasadniczo dąży do określenia ilości bakterii typu tlenowego mezofilnego, to znaczy takich, które rozwijają się w temperaturach od 25 do 40 ° C, przy optymalnej temperaturze wzrostu 37 ° C..
Ta grupa bakterii jest bardzo ważna, ponieważ znajduje się tam większość bakterii chorobotwórczych dla człowieka..
Należy zauważyć, że czasami interesujące może być ilościowe określenie ilości bakterii psychrofilnych obecnych w żywności. Te bakterie to te, które rozwijają się w niskich temperaturach (< 20°C) y son las responsables de que los alimentos se descompongan más rápido, aun estando en nevera.
Podobnie bakterie termofilne, które rozwijają się w zakresie od 50 ° C do 80 ° C lub więcej, mogą być ważne w niektórych typach żywności, takich jak żywność w puszkach..
Oznaczanie ilościowe drobnoustrojów jest wyrażane w jednostkach tworzących kolonie (CFU) na gram lub mililitr próbki.
Indeks artykułów
Standardowe podłoże zliczające jest zaprojektowane tak, aby umożliwić pomyślny wzrost niewymagających wybrednych bakterii tlenowych, ponieważ ekstrakt z drożdży, tryptyna i glukoza zapewniają składniki odżywcze niezbędne do dobrego wzrostu drobnoustrojów..
Z drugiej strony podłoże ma jasny kolor i przezroczysty wygląd, dlatego idealnie nadaje się do wizualizacji kolonii wytworzonych metodą głębokiego wysiewu (wylewanie płytkowe)..
Możliwe jest również zliczanie kolonii metodą wysiewu powierzchniowego szpatułki Drigalskiego..
Gdy ładunek drobnoustrojów jest wysoki, należy wykonać dziesiętne rozcieńczenia badanej próbki, aby można było policzyć CFU.
Należy zauważyć, że podłoże to jest zalecane przez Amerykańskie Stowarzyszenie Zdrowia Publicznego (APHA) do zliczania tlenowych mezofilów..
Odważyć 23,5 g odwodnionej pożywki i rozpuścić w jednym litrze wody destylowanej. Aby całkowicie się rozpuścić, mieszaninę należy podgrzewać, często mieszając, aż do wrzenia. Kolejne kroki zależą od zastosowanej techniki wysiewu.
Rozprowadzić, umieszczając 12–15 ml w probówkach. Następnie sterylizuj w autoklawie w 121 ° C przez 15 minut. Pozwól zestalić się pionowo w kształcie bloku. Przechowywać w lodówce do czasu użycia.
Rozpuść wtyczkę, kiedy będziesz jej używać. Po stopieniu trzymaj go w łaźni wodnej o temperaturze 44-47 ° C do czasu przygotowania próbek..
Sterylizuj pożywkę w autoklawie w 121 ° C, a następnie rozprowadź 20 ml na sterylnych szalkach Petriego. Pozostawić do zestalenia, odwrócić i przechowywać w lodówce do czasu użycia.
Przed użyciem należy wygładzić płytki. PH pożywki musi wynosić 7,0 ± 0,2.
Standard Count Agar jest stosowany w tlenowej technice zliczania mezofilów podczas analizy mikrobiologicznej wody i żywności. Zliczanie tlenowych mezofilów jest konieczne, ponieważ decyduje o jakości sanitarnej badanej próbki..
Zastosowanie tej techniki (przy użyciu tej pożywki) pozwala na makroskopową wizualizację izolowanych kolonii w celu ich ilościowego oznaczenia..
Technika składa się z następujących elementów:
1) Homogenizuj próbkę, aby rozprowadzić obecne bakterie.
2) Wstępną zawiesinę sporządza się w sterylnej butelce lub worku, zachowując proporcje 10 gr lub 10 ml próbki w 90 ml rozcieńczalnika (10-1).
3) Z początkowej zawiesiny należy sporządzić odpowiednie dziesiętne rozcieńczenia w zależności od rodzaju próbki. Np .: (10-dwa, 10-3, 10-4). Rozcieńczenia wykonuje się za pomocą wody peptonowej lub buforu fosforanowego..
Aby to zrobić, weź 1 ml początkowej zawiesiny i umieść ją w 9 ml rozcieńczalnika, kontynuuj rozcieńczanie, jeśli to konieczne, teraz pobierając 1 ml rozcieńczenia 10-dwa i tak dalej.
4) Pobrać 1 ml każdego rozcieńczenia i umieścić na pustych sterylnych szalkach Petriego.
5) Do każdej płytki dodać 12–15 ml standardowego agaru, uprzednio stopionego i osadzonego w temperaturze 44–47 ° C.
6) Delikatnie obróć płytki, aby równomiernie rozprowadzić próbkę wzdłuż agaru i pozostawić do zestalenia..
7) Odwróć płytki i inkubuj w temperaturze 37 ° C w aerobiozie przez 24 do 48 godzin.
8) Pod koniec czasu płytki są badane i kolonie są liczone w rozcieńczeniu, które na to pozwala. Do zliczenia wybiera się te płytki, które mają od 30 do 300 CFU.
Liczenie można wykonać ręcznie lub można skorzystać ze sprzętu do liczenia kolonii.
Dopuszczalne wartości na ml próbki mogą się różnić w zależności od kraju, w zależności od przepisów, którym podlegają..
Ogólne obliczenia są wykonywane przy użyciu następującego wzoru:
Wyniki należy wyrazić za pomocą 1 lub 2 cyfr, mnożąc przez odpowiednią podstawę 10. Przykład: jeśli wynik to 16545, zaokrągla się go w oparciu o trzecią cyfrę do 17 000 i będzie wyrażony w następujący sposób: 1,7 x 104. Teraz, jeśli wynik wynosiłby 16 436, zaokrąglij go do 16 000 i wyrażaj 1,6 x 104.
-Zaszczepić 0,1 ml próbki bezpośredniej, jeśli jest płynna, zawiesina początkowa 10-1 lub 10 kolejnych rozcieńczeń-dwa, 10-3 itp., na środku standardowej płytki z agarem.
-Równomiernie rozprowadź próbkę szpatułką Drigalskiego lub szklanym prętem w kształcie litery L. Odstaw na 10 minut.
-Odwrócić płytki i inkubować w warunkach tlenowych w 37 ° C przez 24 do 48 godzin.
-Kontynuuj liczenie kolonii, wybierz te płytki, które są w zakresie od 20 do 250 CFU.
Do obliczeń stosuje się współczynnik rozcieńczenia, który jest odwrotnością. Liczbę zaokrągla się do 2 cyfr znaczących (zaokrąglenie zgodnie z trzecią cyfrą) i wyraża jako potęgę podstawy 10. Na przykład, jeśli w próbce bez rozcieńczenia policzono 224 CFU (10-1), Zgłaszane jest 22 x 101 UFC, ale jeśli liczba ta wynosiła 225, to 23 x 101 UFC.
Teraz, jeśli policzysz 199 CFU w rozcieńczeniu 10-3, zostanie zgłoszone 20 x 104 CFU, ale jeśli 153 CFU zostanie policzone w tym samym rozcieńczeniu, zostanie zgłoszone 15 x 104 UFC.
Standardową pożywkę hodowlaną można ocenić przy użyciu certyfikowanych znanych szczepów, takich jak: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022.
Jeśli pożywka hodowlana jest w optymalnych warunkach, we wszystkich przypadkach, z wyjątkiem przypadków, oczekuje się zadowalającego wzrostu L. fermentum które mogą mieć regularne wyniki.
Aby ocenić jałowość pożywki hodowlanej, jedną lub dwie płytki z każdej przygotowanej partii (bez posiewu) należy inkubować w temperaturze 37 ° C w warunkach aerobiozy przez 24 godziny. Po tym czasie nie należy obserwować wzrostu ani zmiany koloru pożywki..
-Nie rozpuszczaj agaru więcej niż jeden raz.
-Przygotowane podłoże może trwać do 3 miesięcy, o ile jest przechowywane w lodówce i chronione przed światłem..
-To podłoże nie jest odpowiednie dla drobnoustrojów wybrednych lub beztlenowych.
Jeszcze bez komentarzy