Plik Agar TSI o Agar z potrójnym cukrem i żelazem to stała pożywka hodowlana, która służy jako test biochemiczny prowadzący do wstępnej identyfikacji pałeczek Gram-ujemnych. Opiera się na pokazaniu fermentacji obecnych cukrów oraz produkcji siarkowodoru i gazu.
Jego skład i podstawa są bardzo podobne do testu żelazowego Kliglera, z tą różnicą, że ten ostatni zawiera tylko glukozę i laktozę. Z drugiej strony - jak sama nazwa wskazuje - agar z potrójnym cukrem i żelazem zawiera trzy ulegające fermentacji węglowodany: glukozę, laktozę i sacharozę..
Ponadto podłoże TSI zawiera cztery pochodne białek, które czynią z niego bardzo pożywny agar: ekstrakt drożdżowy, ekstrakt mięsny, pepton i pepton proteozowy. Zawiera również żelazawy siarczan amonu, tiosiarczan sodu, chlorek sodu, czerwień fenolową i agar.
Niezdolność mikroorganizmu do fermentacji glukozy obecnej w pożywce natychmiast wyklucza go z przynależności do rodziny Enterobacteriaceae. W związku z tym test ten jest niezbędny przy podejmowaniu decyzji, którą drogę identyfikacji należy obrać, aby określić rodzaj i gatunek..
Każde laboratorium decyduje, czy pracować z agarem TSI, czy z agarem żelaznym Kliglera..
Indeks artykułów
Każdy ze związków pełni w medium jakąś funkcję.
Chlorek sodu jest niezbędny do utrzymania równowagi osmotycznej pożywki. Podczas gdy agar nadaje mu stałą konsystencję.
PH przygotowanej pożywki jest zrównoważone i wynosi 7,3, a wskaźnik pH (czerwień fenolowa) zmienia kolor na żółty poniżej 6,8. Oznacza to, że niewielkie ilości kwasów wytwarzanych podczas fermentacji cukrów zmienią pożywkę z czerwono-pomarańczowej na żółtą..
Jeśli fermentacja nie nastąpi, nastąpi alkalizacja pożywki za pomocą peptonów, zmieniając kolor z czerwono-pomarańczowego na mocno czerwony.
Kiedy bakterie metabolizują białka obecne w agarze TSI, wytwarzane są aminy, które alkalizują podłoże (głównie na poziomie fazowym), ponieważ reakcja wymaga tlenu. Aminy powodują, że oprawka jest jaskrawoczerwona.
Ale będzie to zależeć od zdolności bakterii do fermentacji węglowodanów, czy nie..
Badanie fermentacji cukrów może dać kilka obrazów, a każdy z nich jest inaczej interpretowany. Interpretacja testu dzieli mikroorganizmy na 3 kategorie: produkty niefermentujące glukozy, produkty niefermentujące laktozy i fermentatory laktozy / sacharozy..
Należy zaznaczyć, że ilość glukozy w pożywce jest ograniczona, natomiast stężenie laktozy i sacharozy jest 10-krotnie wyższe..
Bakterie z rodziny Enterobacteriaceae i inne mikroorganizmy powodujące fermentację glukozy zaczną fermentować ten cukier, ponieważ jest to najprostszy węglowodan energetyczny..
Z drugiej strony laktoza i sacharoza to węglowodany złożone, które muszą zostać rozbite i przekształcone w glukozę, aby mogły wejść w cykl Embdena-Meyerhofa..
Kiedy zaszczepiony mikroorganizm nie jest w stanie fermentować glukozy, znacznie mniej będzie w stanie fermentować innych węglowodanów. Dlatego nie powstają tutaj kwasy, ale w skosie powstają aminy z powodu użycia peptonów.
W takim przypadku ramka zmienia kolor na mocniejszy czerwony, a spód tubusu może pozostać niezmieniony lub też może zostać zalkalizowany, pozostawiając cały tubus czerwony..
Interpretacja: K / K oznacza zasadowe ukosowanie / zasadowe lub obojętne dno
Na ilustracji na początku artykułu zobacz zdjęcie rury D..
Wynik ten wskazuje, że mikroorganizm nie należy do rodziny Enterobacteriaceae..
Jeśli bakterie są w stanie fermentować glukozę, ale nie laktozę lub sacharozę, nastąpi:
Bakterie zużyją całą obecną glukozę po około 6 do 8 godzinach, będąc w stanie zakwaszać zarówno fazę, jak i blok; to znaczy, agar całkowicie zmieni kolor na żółty. Ale kiedy poziom glukozy się wyczerpie i nie będzie można użyć laktozy i sacharozy, bakterie rozpoczną metabolizm białek.
Ta reakcja wymaga tlenu, dlatego degradacja peptonów następuje na powierzchni (skos). Wytworzone aminy alkalizują ramkę, zmieniając kolor z żółtego na czerwony. Ta reakcja jest widoczna po 18 do 24 godzinach inkubacji..
Interpretacja: K / A oznacza fazę alkaliczną i zwitek kwasowy.
Na obrazku na początku artykułu zobacz zdjęcie rury B.
Mikroorganizmy zdolne do fermentacji laktozy i sacharozy mogą oczywiście fermentować glukozę. Po wyczerpaniu minimalnej ilości glukozy obecnej w pożywce utworzony pirogronian zaczyna metabolizować do kwasów w tlenowym cyklu Krebsa, a po upływie 8 do 12 godzin całe podłoże będzie żółte..
Jeśli bakterie są w stanie rozłożyć laktozę lub sacharozę, kwasy będą nadal wytwarzane, a po 18 do 24 godzinach cała probówka - skos i korek - będzie nadal żółknąć.
Należy zauważyć, że glukozę stosuje się na dwa sposoby: jeden tlenowy na skosie probówki, a drugi beztlenowy na dnie probówki..
Interpretacja: A / A oznacza fazę kwasową / dno kwasowe. Może lub nie może przedstawiać gazu.
Na ilustracji na początku artykułu zobacz zdjęcie rury A.
Niektóre mikroorganizmy są zdolne do wytwarzania gazu podczas fermentacji cukrów. Obecność gazu w probówce jest potwierdzona przez ciśnienie, jakie wywiera w agarze. Ciśnienie powoduje tworzenie się pęcherzyków lub przemieszczanie agaru. Czasami tworzenie się gazu może spowodować pęknięcie medium.
Ważne jest, aby podczas wysiewu pożywki TSI nakłuć czysto środek agaru, aż sięgnie dna. Jeśli nakłucie zostanie skierowane w stronę ścianek rurki, może to spowodować fałszywe alarmy w produkcji gazu, ponieważ wydostanie się on przez źle uformowany kanał.
Produkcja gazu, jak również reakcje zachodzące w skosie agarowym, wymagają tlenu, dlatego zaleca się, aby probówkę przykryć bawełnianą zatyczką, a jeśli używa się nasadki bakelitowej, nie powinna być całkowicie szczelna..
Produkcja gazu jest zgłaszana jako dodatnia (+) lub ujemna (-).
Bakterie zdolne do wytwarzania siarkowodoru (bezbarwnego gazu) pobierają siarkę z tiosiarczanu sodu obecnego w pożywce. Kiedyś H.dwaS reaguje z siarczanem żelazawo-amonowym, tworząc siarczek żelaza (wyraźnie widoczny czarny osad).
Produkcja H.dwaS jest zgłaszane jako dodatnie (+) lub ujemne (-).
Na ilustracji na początku artykułu zobacz ilustrację rury C.
Odważyć 62,5 g odwodnionego agaru z potrójnym cukrem i żelazem (TSI) i rozpuścić w jednym litrze wody destylowanej..
Ogrzewać, aż agar całkowicie się rozpuści. Gotować przez minutę, często mieszając. Rozprowadzić 4 ml pożywki do probówek 13/100 z bawełnianymi zatyczkami.
Sterylizuj w autoklawie w 121 ° C przez 15 minut. Wyjąć z autoklawu i odstawić pod kątem. Należy uważać, aby zarówno podstawa, jak i maskownica znajdowały się w tej samej odległości.
Przechowywać w lodówce 2-8 ° C. Pozostaw do ogrzania przed wysianiem szczepu bakteryjnego.
Odwodnione podłoże ma kolor jasnobeżowy, a przygotowane podłoże czerwono-pomarańczowe.
Końcowe pH przygotowanej pożywki wynosi 7,3 ± 0,2.
Test TSI jest szeroko stosowany na poziomie laboratoriów mikrobiologicznych. Ten test ma zasadnicze znaczenie dla określenia rodzaju testu, który należy zastosować, aby określić rodzaj i gatunek. Jego dobre wykonanie i interpretacja może zaoszczędzić materiał i pracę.
Jeżeli wynik to TSI K / K, a test oksydazy cytochromowej jest pozytywny, wiadomo, że do identyfikacji niefermentujących pałeczek Gram-ujemnych, takich jak między innymi Pseudomonas, Alcaligenes, Achromobacter, Burkholderia, należy zastosować testy. Jeśli jest oksydazo-ujemny, jest zorientowany na rodzaje Acinetobacter, Stenotrophomonas itp..
Z drugiej strony, jeśli uzyskamy TSI A / A lub K / A i wynik testu oksydazy cytochromowej jest ujemny, im więcej azotanów zostanie zredukowanych do azotynów, będziemy mieć pewność, że jest to mikroorganizm należący do rodziny Enterobacteriaceae. W tym przypadku droga identyfikacji skupi się na konkretnych testach dla tej grupy bakterii..
Z drugiej strony, jeśli uzyskany zostanie obraz K / A lub A / A i wynik testu oksydazy cytochromowej będzie pozytywny, dodatkowe testy, które zostaną zebrane, będą miały na celu identyfikację szczepów fermentujących, które nie należą do rodziny Enterobacteriaceae, takich jak: jako: Aeromonas, Plesiomonas, Vibrio i Pasteurella.
TSI z siarkowodorem, oksydazo-ujemna, ułatwi identyfikację następujących rodzajów z rodziny Enterobacteriaceae: Proteus, Citrobacter, Edwardsiella, Leminorella, Pragia, Trabusiella lub Salmonella.
TSI z niewielkim lub umiarkowanym siarkowodorem w fazie alkalicznej z tłem alkalicznym i dodatnią oksydazą będzie stanowić wytyczne dla stosowania testów do identyfikacji niefermentujących pałeczek Gram-ujemnych wytwarzających HdwaTak, tak jak Shewanella putrefaciens.
Wreszcie TSI może być wykorzystywana do badania produkcji siarkowodoru przez pałeczki Gram-dodatnie, zwłaszcza gdy podejrzewa się, że Erysipelothrix rhusiopathiae.
Pożywkę TSI należy zaszczepić czystymi koloniami, wyizolowanymi w kulturach pierwotnych lub selektywnych. Jeśli kolonia jest pobierana z pożywek selekcyjnych, które były wysiane próbkami z mieszaną florą, należy uważać, aby pobierać tylko z powierzchni, ponieważ żywe szczepy hamowane w tej pożywce mogą występować w dolnej części kolonii..
Dlatego pętla nigdy nie powinna być chłodzona na selektywnej pożywce, aby później pobrać kolonię i zaszczepić pożywkę TSI..
Siew zostanie wykonany za pomocą prostej pętli lub igły. Wykonane zostanie nakłucie, uważając, aby przechodziło przez środek środka aż do osiągnięcia dna, a następnie wysiew jest zakończony zaszczepieniem powierzchni w kształcie zygzaka. Nie rób dwóch nakłuć.
Inkubować w temperaturze 37 ° C w aerobiozie przez 18-24 godzin. Interpretuj w tym czasie, ani przed, ani po.
Test TSI należy odczytać w ciągu 18–24 godzin od inkubacji. Odczyt przed tym czasem może dać fałszywie pozytywny wynik dla fermentacji A / A. Zważywszy, że odczyt po tym czasie może spowodować fałszywie negatywny obraz urządzenia niefermentującego, ze względu na zużycie peptonów, które alkalizują pożywkę..
Jeszcze bez komentarzy