Plik proteinaza K. Jest enzymem należącym do grupy proteaz serynowych, czyli posiada w swoim aktywnym centrum katalitycznym aminokwas serynę i pełni funkcję rozrywania wiązań peptydowych na drodze hydrolizy. Z kolei enzym ten należy do rodziny białek subtylizyny (peptydaza S8).
Proteinaza K ma masę cząsteczkową (MW) 28.900 daltonów i została po raz pierwszy wyizolowana w 1974 roku w ekstraktach z grzyba Album Engyodontium, formalnie znany jako Album Tritirachium Limber.
Ma wysoką zdolność proteolityczną, przejawiającą się zdolnością do degradacji keratyny obecnej we włosach. Słowo keratyna w języku angielskim jest napisane „keratyna”, dlatego zostało nazwane „proteinazą K”.
Ze względu na dużą zdolność rozszczepiania natywnych białek enzym ten jest przydatny w różnych technikach biologii molekularnej. Stosowany głównie do izolacji i przygotowania kwasów nukleinowych o dużej masie cząsteczkowej (MW).
Proteinaza K działa poprzez uwalnianie jądrowego DNA, jednocześnie niszcząc białka oraz inaktywuje RNazy i DNazy, czyli eliminuje nukleazy w preparatach DNA i RNA..
Z drugiej strony zaobserwowano, że proteinaza K może hydrolizować niektóre zdenaturowane białka natywne, co wzbudziło zainteresowanie naukowców jej zastosowaniem w badaniach białek prionowych (PrPC).
Jednak pomimo ich wysokiej siły proteolitycznej istnieją białka, które są oporne na działanie proteinazy K. Wśród nich są niektóre nieprawidłowe białka zwane prionami (PrPSc), związane z pasażowalnymi encefalopatiami gąbczastymi..
Indeks artykułów
Proteinaza K ma trzeciorzędową strukturę składającą się z trzech warstw, z siedmiłańcuchowym arkuszem β umieszczonym między dwiema warstwami helis. Ponieważ należy do rodziny peptydaz S8, charakteryzuje się triadą katalityczną w miejscu aktywnym, której kolejność to (Asp, His i Ser), co odróżnia je od innych rodzin peptydaz..
Enzym z grupy proteaz serynowych charakteryzuje się hydrolizą wiązań peptydowych bliskich grupie karboksylowej aminokwasów alifatycznych i aromatycznych..
Z drugiej strony jest zdolny do działania w obecności pewnych substancji żrących, takich jak dodecylosiarczan sodu (SDS), Tris-HCL i EDTA, które pomagają w denaturacji białek, powodując utratę ich natywnej struktury ..
Jest to wstępny etap przygotowania białek do techniki elektroforezy. Zakres pH, w którym działa proteinaza K, jest dość szeroki (2,0 do 12,0), z optymalnym pH między 7,5 a 12,0, a jej punkt izoelektryczny wynosi 8,9. Jak widać, działa w bardzo szerokim zakresie pH..
Inną cechą wyróżniającą proteinazę K jest jej stabilność w obecności wysokich temperatur (50 - 60 ° C)..
Proteinaza K wymaga obecności jonu wapnia, chociaż nie wpływa to na jej aktywność, jeśli konieczne jest utrzymanie jej stabilności.
Aby proteinaza K w pełni strawiła substrat, wymagany jest czas kontaktu wynoszący około 5 minut do 2 godzin..
Jednak w tym sensie Daza i wsp. Porównali czystość DNA otrzymanego przy różnych czasach ekspozycji na proteinazę K i doszli do wniosku, że przedłużona inkubacja (do 24 godzin) znacząco poprawia jakość DNA..
Teraz, w odniesieniu do stężenia enzymu proteinazy K używanego w różnych protokołach, można powiedzieć, że jest ono bardzo zróżnicowane.
Może być stosowany od bardzo niskich stężeń (5 µg / ml) do stężeń 500 µg / ml. Jednak najczęściej stosowane stężenia mieszczą się w zakresie 50-100 μg / ml, szczególnie w przypadku trawienia białek i inaktywacji nukleaz. Chociaż do leczenia tkanek wymagane jest stężenie 2 mg / ml.
Jego zastosowania są bardzo szerokie i można je podsumować następująco:
-Znajduje zastosowanie w trawieniu białek i ekstrakcji DNA różnymi metodami, takimi jak: wysalanie, PK-SDS, bromek cetylotrimetyloamoniowy (CTAB), modyfikowany octan potasu oraz ekstrakcja jodkiem sodu..
-Inaktywacja nukleaz (RNazy i DNazy).
-W technice hybrydyzacji in situ (HIS), aby wspomóc uwalnianie kwasu nukleinowego, oprócz usuwania niepożądanych białek.
-Modyfikacja białka.
-Na poziomie badawczym, w różnych badaniach.
Przeprowadzono kilka badań porównawczych między technikami ekstrakcji DNA, które wykorzystują proteinazę K, a innymi, które jej nie używają, i wszyscy doszli do wniosku, że stosowanie enzymu przynosi większe korzyści. Zalety obejmują:
-Uzyskuje się DNA o wysokiej masie cząsteczkowej, wysokiej jakości i czystości.
-Wyekstrahowany DNA jest stabilny do 3 miesięcy.
Wyekstrahowany DNA można wykorzystać między innymi w następujących technikach: Southern blot, łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR), elektroforeza..
Różne badania wykazały, że priony (nieprawidłowe toksyczne białka PrPSc) różnią się od białek PrPC (natywnych) odpornością na działanie proteinazy K, podczas gdy PrPC są wrażliwe na jej działanie.
Inni autorzy opisali, że w strukturze PrPSc są fragmenty wrażliwe i inne odporne na proteinazę K. Jednak obie części są równie toksyczne i zakaźne..
Z drugiej strony Bastian i wsp. W 1987 roku wyizolowali 4 białka o masie 28, 30, 66 i 76 kda z gatunku Spiroplasma mirum. Wszystkie okazały się odporne na działanie proteinazy K, a także wykazywały reakcję krzyżową z niektórymi prionami..
Wiadomo, że gatunek ten może powodować zaćmę i znaczne uszkodzenia neurologiczne, a dzięki odkryciom naukowym Bastiana, między innymi badaniami, podjęto próbę powiązania tego drobnoustroju z pasażowalnymi encefalopatiami gąbczastymi..
Jednak etiologię tej zwyrodnieniowej patologii neurologicznej nadal przypisuje się prionom..
W tym sensie Butler i wsp. W 1991 roku zidentyfikowali i scharakteryzowali klasę białek odpornych na proteinazę K o masie 40 kda z dwóch szczepów Mycoplasma hyorhinis. Patogen ten atakuje świnie, infekując ich tkanki, ale w tym przypadku nie wystąpiła reakcja krzyżowa z badanymi prionami..
Konieczne są dalsze badania, aby wyjaśnić wiele niewiadomych w tym zakresie.
Jeszcze bez komentarzy