Plik test katalazy to metodologia stosowana w laboratoriach bakteriologicznych w celu wykrycia obecności enzymu katalazy w bakteriach, które go posiadają. Wraz z barwieniem Grama są to główne testy, które należy wykonać na nowo wyizolowanych mikroorganizmach. Testy te prowadzą mikrobiologa do kroków, które należy podjąć w celu ostatecznej identyfikacji danego mikroorganizmu..
Ogólnie bakterie zawierające cytochrom posiadają enzym katalazę, co oznacza, że fakultatywnie powinny go posiadać bakterie tlenowe i beztlenowe. Istnieją jednak wyjątki, takie jak Streptococcus, które pomimo tego, że są fakultatywnie beztlenowymi mikroorganizmami, nie mają enzymu katalazy.
Z tego powodu test na katalazę jest stosowany głównie do rozróżnienia rodzin Staphylococaceae i Micrococaceae (obie katalazy dodatnie) od rodziny Streptococaceae (katalazy ujemne)..
Podobnie, rodzaj Bacillus (katalazy dodatnia) odróżnia się od rodzaju Clostridium (katalazy ujemna), między innymi.
Indeks artykułów
Katalaza to enzym zaliczany do hydroperoksydaz, co oznacza, że wykorzystują nadtlenek wodoru (H.dwaLUBdwa).
Jest również uważana za oksydoreduktazę, ponieważ w reakcji, w której uczestniczy, występuje pierwiastek, który służy jako donor elektronów (substancja redukująca), a inny jako receptor elektronów (substancja utleniająca).
Katalaza to białko zawierające grupę proseryczną z czterema trójwartościowymi atomami żelaza (Fe+++), dlatego jest homoproteiną. Podczas reakcji jon żelazowy pozostaje utleniony.
Można powiedzieć, że katalaza jest enzymem odtruwającym, gdyż jego funkcją jest eliminacja toksycznych dla bakterii substancji wytwarzanych podczas metabolizmu bakterii. Wśród tych substancji jest nadtlenek wodoru.
Nadtlenek wodoru powstaje z tlenowego rozkładu cukrów. Ten proces przebiega w następujący sposób:
Jon ponadtlenkowy (Odwa-) (wolny rodnik) powstaje jako produkt końcowy asymilacji glukozy drogą tlenową. Jest to toksyczne i jest eliminowane przez enzym dysmutazę ponadtlenkową, która przekształca go w gazowy tlen i nadtlenek wodoru.
Nadtlenek wodoru jest również toksyczny dla bakterii i musi zostać usunięty. Enzym katalaza rozkłada nadtlenek wodoru na wodę i tlen.
Katalaza może działać na substraty inne niż nadtlenek wodoru, takie jak alkohole, aldehydy, kwasy, aminy aromatyczne i fenole. Jednak nadtlenek wodoru może być również stosowany przez katalazę do utleniania innych toksycznych związków, takich jak alkohol metylowy i etylowy..
Podobnie katalaza jest obecna w komórkach fagocytarnych, chroniąc ją przed toksycznym działaniem nadtlenku wodoru..
3% nadtlenek wodoru (10 objętości).
Slajd mikroskopowy
Jednorazowy plastikowy uchwyt lub drewniana wykałaczka.
Weź wystarczającą ilość kolonii do zbadania bez dotykania agaru, z którego pochodzi. Kolonia musi być świeża, to znaczy pochodzić z kultury trwającej od 18 do 24 godzin.
Umieść kolonię na suchym szkiełku i dodaj kroplę 3% nadtlenku wodoru (możesz też użyć H.dwaLUBdwa 30%). Natychmiast obserwuj, czy pęcherzyki są uwalniane, czy nie.
Reakcja pozytywna: wydzielanie się gazu, potwierdzone tworzeniem się pęcherzyków (silne bulgotanie).
Reakcja negatywna: brak tworzenia się pęcherzyków.
Umieść 1 ml HdwaLUBdwa 3% na czystej płytce lub hodowli klinowej, która nie zawiera krwi (najlepiej agar odżywczy). Natychmiast obserwuj, czy nie powstają pęcherzyki. Możesz również użyć H.dwaLUBdwa 30%.
Jest interpretowana tak samo, jak metoda obiektu porta.
Wypełnij kapilarę o średnicy 67 mm do wysokości 20 mm 3% roztworem nadtlenku wodoru na zasadzie kapilarności.
Dotknij izolowanej kolonii, która ma być badana, kapilarą pełną H.dwaLUBdwa przy 3%. Obserwuj, czy kapilara wypełnia się bąbelkami w ciągu około 10 sekund. Ta metoda pozwala na półilościowe oznaczenie reakcji w krzyżykach:
Bez krzyżyków, bez pęcherzyków (reakcja negatywna).
+ --Kilka pęcherzyków (słaba lub opóźniona reakcja).
++ -Obfite bąbelki (umiarkowana reakcja).
+++ -Bąbelki osiągają przeciwną skrajność (reakcja energetyczna).
Na czystym, suchym szkiełku umieść izolowaną kolonię, a następnie umieść kroplę H.dwaLUBdwa 0,5% i przykryć szkiełkiem nakrywkowym. Obserwuj, czy nie tworzą się uwięzione pęcherzyki.
Interpretacja: obecność pęcherzyków wskazuje na pozytywną reakcję. Brak pęcherzyków, jest to interpretowane jako reakcja negatywna.
Tę technikę należy wykonać kontrolując pH i temperaturę. Musi być wykonywany pod wyciągiem z przepływem laminarnym, ponieważ manipulowanie różnymi gatunkami Mycobacterium jest niebezpieczne.
Nadtlenek wodoru 30% lub 110 objętości (ponadtlen).
Bufor fosforanowy pH 7
10% Tween 80
Hodowla klinowa Mycobacterium przez 3 do 4 tygodni
Ważyć:
1,361 g (KHdwaPO4) bezwodny fosforan monopotasowy.
1,420 g bezwodnego fosforanu disodu (Na2HPO3).
Obie sole rozpuścić w niewielkiej ilości sterylnej wody destylowanej i uzupełnić wodą do 1000 ml.
Rozcieńczyć w stosunku 1:10 Tween 80, który jest komercyjnie stężony, w tym celu postępować w następujący sposób:
Weź 1 ml Tween 80 i umieść go w niewielkiej ilości wody destylowanej, rozpuść, a następnie uzupełnij objętość wodą do 10 ml.
Zmieszać pewną ilość buforu fosforanowego z ilością 10% Tween 80 (w równych częściach). Określ w laboratorium, ile chcesz przygotować.
Umieść 5 ml buforu fosforanowego w sterylnej probówce z zakrętką (bakelit).
Za pomocą pętli zaszczepiającej weź wystarczającą ilość kolonii Mycobacterium zaszczepionych w ćwiartkach i rozpuść w buforze fosforanowym.
Zakryj rurkę bez nadmiernego dokręcania gwintu. Umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 68 ° C na 20 do 30 minut. Wyjąć i schłodzić do 22-25 ° C
Odmierz 0,5 ml końcowego odczynnika (wymieszaj) i dodaj go do probówki z zimnym roztworem. Obserwuj tworzenie się pęcherzyków lub ich brak.
Jest interpretowany tak samo, jak poprzednie techniki.
Po uzyskaniu wzrostu kolonii we wzbogaconej pożywce należy na otrzymanych koloniach przeprowadzić barwienie metodą Grama i test katalazy. To wskaże mikrobiologowi procedury, których należy przestrzegać w celu ostatecznej identyfikacji..
Aby ocenić dobre działanie odczynnika nadtlenku wodoru, użyj świeżo wyhodowanych szczepów kontrolnych, takich jak Staphylococcus aureus jako kontrola pozytywna i szczepy Streptococcus sp jako kontrola negatywna.
Inną alternatywą, która służy jako kontrola pozytywna, jest umieszczenie kropli nadtlenku wodoru na agarze z krwią, erytrocyty mają katalazę, dlatego będzie bulgotanie, jeśli odczynnik jest w dobrym stanie.
Agar czekoladowy może być użyty jako kontrola negatywna, tutaj erytrocyty są już zlizowane, a test jest ujemny.
-Nie używaj do testu starych kultur, ponieważ może to prowadzić do fałszywych wyników negatywnych.
-Unikaj pobierania kolonii z posiewów na agarze z krwią, uważając, aby nie dotykać agaru; procedura ta może prowadzić do fałszywie dodatnich wyników, ponieważ erytrocyty zawierają katalazę.
-Jeśli weźmiesz wodę kolońską z platyny, nie zmieniaj kolejności procedury, ponieważ może to prowadzić do fałszywych alarmów. Dzieje się tak, ponieważ platyna może reagować z nadtlenkiem wodoru, powodując bulgotanie..
-Nie używaj odczynnika nadtlenku wodoru, jeśli jest bardzo stary, ponieważ jest on bardzo niestabilny i z czasem ulega rozkładowi..
-Przechowuj odczynnik nadtlenku wodoru chroniony przed światłem i w lodówce, aby uniknąć uszkodzeń..
-Za każdym razem, gdy jest używany, należy przeprowadzić kontrolę jakości odczynnika nadtlenku wodoru.
-Weź pod uwagę, że jeśli HdwaLUBdwa przy 30% reakcje są silniejsze niż te przeprowadzone z HdwaLUBdwa przy 3%.
Jeszcze bez komentarzy