Plik test koagulazy jest to technika laboratoryjna wykorzystywana do wykrycia obecności enzymu koagulazy. Enzym ten ma właściwość koagulacji osocza. Loeb w 1903 roku jako pierwszy opisał ten enzym.
Test ten jest wykonywany na ziarniakach Gram-dodatnich, katalazododatnich, pozwalających na rozróżnienie szczepów Staphylococcus aureus od reszty gronkowców, ponieważ jest to jedyny mikroorganizm o znaczeniu klinicznym, który go produkuje.
W tym sensie, członkowie rodziny Staphylococaceae, którzy mają negatywny wynik testu, są często nazywani gronkowcami koagulazo-ujemnymi..
Istnieje kilka różnych odmian S. aureus które mogą wytwarzać koagulazę, np Staphylococcus schleiferi spp coagulans, S. hyicus, S.medius i S. delphini.
Jednak pierwsze trzy mają znaczenie kliniczne na poziomie weterynaryjnym i bardzo rzadko można je znaleźć jako czynnik sprawczy zakażeń u ludzi, podczas gdy S. delphini występuje tylko w środowiskach morskich.
Ponadto łatwo je rozróżnić, ponieważ S. hyicus Y S.medius nie fermentują mannitolu i S. schleiferi spp coagulans podczas gdy nie fermentuje maltozy ani trehalozy S. aureus fermentuje te węglowodany.
Obecność enzymu koagulazy została powiązana z zjadliwością szczepów. Jednak teoria ta upadła, biorąc pod uwagę fakt, że obserwuje się inne zjadliwe gatunki koagulazo-ujemne zdolne do wywoływania ważnych infekcji..
Indeks artykułów
Staphylococcus aureus wytwarza dwa typy koagulazy, jedną, która pozostaje przyczepiona do ściany komórkowej, zwaną także czynnikiem aglutynacji lub reaktywnym czynnikiem koagulazy (CRF), oraz zewnątrzkomórkową, która jest uwalniana w płynnych hodowlach. Dlatego nazywa się je odpowiednio związaną koagulazą i wolną koagulazą..
Enzym koagulaza zawdzięcza swoją nazwę działaniu, które wytwarza. Ma zdolność przekształcania fibrynogenu w fibrynę, tworząc wyraźny skrzep, gdy znajduje się w osoczu, to znaczy ten enzym symuluje aktywność trombiny w kaskadzie krzepnięcia.
W rzeczywistości jedną z najpowszechniej akceptowanych teorii jest to, że związana koagulaza reaguje z wolną koagulazą, aktywując czynniki krzepnięcia. Ta aktywacja generuje substancję, która działa podobnie jak protrombina, tworząc związek o funkcji trombiny..
Różnica w stosunku do normalnej kaskady krzepnięcia polega na tym, że reakcja ta nie wymaga obecności wapnia i nie wpływa na nią heparyna.
Aby wykonać test koagulazy, wystarczy zmierzyć się ze świeżą kulturą Staphylococcus z najlepiej osoczem królika i obserwować w ten sposób tworzenie się skrzepu.
Istnieją specyficzne techniki jednoczesnego wykrywania koagulazy związanej oraz koagulazy związanej i wolnej..
Niektóre odmiany S. aureus dają pozytywny wynik szybciej niż inne. Szybkość tworzenia się skrzepów jest wprost proporcjonalna do stężenia obecnej koagulazy..
Test szkiełkowy na koagulazę wykrywa koagulazę związaną, a test probówkowy na koagulazę związaną i wolną.
-Czysty slajd
-Korzystnie można również stosować osocze królicze, ludzkie lub końskie. Osocze można zakupić komercyjnie liofilizowaną i odtworzoną do użycia lub można ją użyć świeżą (świeżą). Inną realną alternatywą jest użycie fibrynogenu.
-Jałowa sól fizjologiczna (0,85%) (SSF).
Narysuj żylną krew ludzką lub zwierzęcą. Można zastosować dowolny z następujących antykoagulantów: EDTA, szczawian wapnia, heparyna lub cytrynian sodu. Dobrze wymieszaj i odwiruj. Aseptycznie usunąć supernatant (osocze) bez czerwonych krwinek i umieścić w sterylnej probówce.
Rekonstytuować zgodnie z instrukcją na fiolce zestawu handlowego.
Używając osocza cytrynianowego, wymieszaj osocze w równych częściach z nasyconym roztworem chlorku sodu. Pozostawić do wytrącenia i odwirować.
Usunąć supernatant, odtworzyć osad do 5-krotnej objętości jałową wodą destylowaną. Dodaj 5 jednostek heparyny na każdy ml fibrynogenu. Przechowywać w sterylnej probówce.
Kroplę roztworu soli i kroplę osocza umieszcza się na szkiełku oddzielnie. Za pomocą pętli platynowej weź 1 lub 2 czyste kolonie badanego mikroorganizmu.
Wymieszaj ładunek bakteryjny w kropli plazmy i powtórz operację na kropli SSF. Natychmiast obserwuj wyniki. Wynik pozytywny to taki, w którym po jednej minucie po stronie kropli z osoczem obserwuje się tworzenie makroskopowego aglutynatu (biały osad).
Kropla SSF służy jako kontrola negatywna. Jeśli aglutynacja jest obserwowana w przypadku SSF, oznacza to, że mikroorganizm samosprzędza się, co może dawać fałszywie dodatnie wyniki. W takim przypadku należy to potwierdzić próbą probówkową.
Zaleca się również zamontowanie kontroli pozytywnej ze znanym szczepem S. aureus.
Aglutynacja w ciągu 5-20 sekund (silny pozytywny test).
Zmienna aglutynacja występująca między 20 sekundami a jedną minutą (opóźniony test pozytywny).
Pewien stopień aglutynacji po minucie (wątpliwe dowody). Zaleca się powtórzenie testu lub potwierdzenie metodą probówkową.
Brak aglutynacji (test negatywny).
Wynik z SSF. Zawsze musi dać wynik negatywny, jeśli da wynik pozytywny automatycznie, wynik testu jest nieważny.
-Sterylna probówka
-Osocze
-Łaźnia wodna w 37 ° C.
Odpipetować 0,5 ml osocza sterylną pipetą do probówki 12 x 75. Do platynowej pętli załadować od 2 do 4 czystych kolonii do badania ze stałej kultury przez 18 do 24 godzin i rozpuścić w osoczu ostrożnie wymieszać i inkubować w 37 ° C przez 4 godziny.
Zbadaj probówkę przez pierwszą godzinę bez potrząsania, po prostu delikatnie ją przechyl. Jeśli skrzep nadal nie jest widoczny, można go obserwować co 30 minut, aż do zakończenia 4 godzin. Jeśli po 4 godzinach nadal jest ujemny, można go pozostawić do 24 godzin, ale w temperaturze pokojowej. Obserwuj i zgłoś wynik.
Opierając się na doświadczeniu, niektórzy mikrobiolodzy zalecają użycie 500 µl zawiesiny bakteryjnej z 18-godzinnej hodowli w płynnej pożywce do wykonania testu..
Wydaje się, że zapewnia szybsze i bardziej wiarygodne wyniki niż w przypadku emulgowania kolonii ze stałych pożywek, zwłaszcza jeśli zastosowano ludzkie osocze uzyskane z banku krwi..
Użycie szczepów z bulionu pomaga rozcieńczyć ewentualną obecność w osoczu ludzkich przeciwciał przeciw gronkowcom, które mogą hamować działanie koagulazy..
W przypadku stwierdzenia skrzepu obejmującego cały płyn (krzepnięcie całkowite) lub skrzepu bez pozostałego płynu (krzepnięcie częściowe), należy to uznać za wynik pozytywny..
Jeśli nie utworzy się skrzep, to znaczy zawiesina pozostaje jednorodna, wynik testu jest ujemny.
Fibrynogen jest używany tak samo jak osocze i jest używany zarówno do testów szkiełkowych, jak i probówek. Postępuj zgodnie z opisem dla osocza i interpretuj w ten sam sposób.
Służy do różnicowania Staphylococcus aureus gronkowców koagulazoujemnych.
Miej świeże kultury odmiany S. aureus do wykorzystania jako kontrola pozytywna. Odmiana S. epidermidis jako kontrola negatywna.
-Pozytywnego testu nie należy pozostawiać w inkubacji przez 24 godziny, ponieważ S. aureus wytwarza fibrynolizynę, która rozpuszcza skrzep.
-Aby uzyskać wiarygodny test, należy użyć świeżego lub świeżo rekonstytuowanego osocza, jak również ważne jest użycie świeżych kultur bakteryjnych (18 do 24 godzin). Pozwala to uniknąć fałszywych negatywów.
-Test należy przeprowadzić w połączeniu z kontrolą negatywną i pozytywną.
-Niektóre stałe media mogą zakłócać test koagulazy. Nie zaleca się stosowania kolonii ze słonego agaru z mannitolem.
-Jeśli używane jest osocze z cytrynianem, zaleca się umieszczenie 5 jednostek heparyny na ml osocza, aby uniknąć fałszywie dodatnich wyników. Dzieje się tak, ponieważ niektóre mikroorganizmy inne niż S. aureus mogą rozkładać cytrynian i powodować krzepnięcie osocza. W takim przypadku wskazane jest wykonanie testu Grama i testu katalazy..
-Ważne jest, aby w teście probówki monitorować reakcję co 30 minut, ponieważ występują odkształcenia S. aureus Wytwarzają wysokie stężenia fibrynolizyny i szybko rozcieńczają nowo utworzony skrzep. Unikaj fałszywych negatywów.
-Podczas monitorowania testu należy unikać gwałtownego potrząsania probówką, może to zniszczyć początek tworzenia się skrzepu, który nie zostanie przywrócony później, powodując fałszywie ujemne wyniki.
Jeszcze bez komentarzy