Plik Test Vogesa-Proskauera to test biochemiczny stosowany do identyfikacji bakterii z rodziny Enterobacteriaceae. Jest szczególnie przydatny do różnicowania szczepów Escherichia coli z Klebsiella i Enterobacter, m.in.
Test przeprowadza się w płynnej pożywce hodowlanej o nazwie Methyl Red-Voges Proskauer, lepiej znanej pod akronimem RM / VP. Pożywka ta składa się ze zbuforowanego polipeptonu, glukozy, fosforanu dipotasowego i wody destylowanej..
Obecna pożywka RM / VP jest modyfikacją pożywki Clarka i Lubsa, która pierwotnie zawierała niższe stężenie peptonów i glukozy. W związku z tym wytworzono mniej jonów wodorowych potrzebnych do dodatniej reakcji Vogesa-Proskauera..
Test opiera się na zdolności mikroorganizmu do wykorzystania glukozy na drodze glikolu butylenowego i utworzenia neutralnego produktu końcowego zwanego acetoiną, w obecności tlenu i zasadowego pH.
W pożywce RM / VP, oprócz możliwości ujawnienia testu Voges-Proskauer, można również ujawnić test czerwieni metylowej.
Indeks artykułów
Pluripeptones obecne w pożywce zapewniają podstawowe wymagania żywieniowe dla wzrostu bakterii. Głównym związkiem jest glukoza. Wiele bakterii ma zdolność metabolizowania glukozy i tworzenia kwasu pirogronowego.
Kwas pirogronowy jest punktem środkowym w metabolizmie glukozy i stamtąd każdy mikroorganizm może obrać inną drogę. Niektóre będą tworzyć kwasy mieszane, takie jak kwas mlekowy, kwas octowy, kwas mrówkowy i kwas bursztynowy, a inne będą tworzyć produkty obojętne, takie jak 2,3-butanodiol..
Test Voges-Proskauer ujawnia zdolność mikroorganizmu do tworzenia acetylometylokarbinolu (acetoiny), produktu pośredniego 2,3-butanodiolu w warunkach tlenowych.
Acetoina ulega redukcji i tworzy 2,3-butanodiol, ale ta reakcja jest odwracalna, więc jeśli 2,3-butanodiol jest utleniony, powstaje acetoina. Dlatego tlen jest niezbędny.
Fosforan dipotasowy jest buforem buforującym mieszaninę do pH 6,9 ± 0,2.
Aby zademonstrować reakcję, wywołanie należy przeprowadzić przy użyciu dwóch odczynników (odczynników Barrita), znanych jako Voges A i Voges B.
Voges A to 5% roztwór α-naftolu, a Voges B to 40% preparat wodorotlenku potasu. Jeśli wodorotlenek potasu nie jest dostępny, można go zastąpić 40% wodorotlenkiem sodu.
Α-Naftol jest katalizatorem, który zwiększa intensywność koloru reakcji, zwiększając czułość testu. Najpierw należy zawsze dodać α-naftol, potrząsając rurką, aby medium zetknęło się z tlenem. W ten sposób obecna acetoina jest utleniana do diacetylu, a 2,3-butanodiol jest utleniany do acetoiny, przechodząc do diacetylu..
W ten sposób α-naftol będzie wiązał się z diacetylem, który z kolei dołączył do jądra guanidyny obecnego w aminokwasie argininie, który pochodzi z pluripeptonów.
Ze swojej strony wodorotlenek potasu lub sodu jest odpowiedzialny za wchłanianie COdwa i reagowania z peptonami. Ta reakcja powoduje powstanie łososiowo-różowego koloru, wyraźnie widocznego po bardzo mocnym wstrząśnięciu probówki..
Prawidłowe ilości diacetylu, peptonu i α-naftolu muszą być zmieszane, aby kolor pojawił się natychmiast. Jeśli tak się nie stanie, przed tłumaczeniem należy pozostawić zgłębnik na odpoczynek przez 15 minut..
Zwykle test jest pozytywny po 2 do 5 minutach, kiedy można zobaczyć blady różowy kolor. W przypadku pozostawienia na 30 min do 1 godziny intensywność koloru będzie maksymalna (intensywna czerwień).
Negatywny wynik testu pojawi się, gdy bulion zmieni kolor na żółty. Po 1 godzinie, jeśli wynik testu jest ujemny, w wyniku reakcji wodorotlenku potasu z α-naftolem może powstać zabarwienie miedzi.
Odważyć 17 g odwodnionej pożywki hodowlanej i rozpuścić w litrze wody destylowanej. Odstaw na 5 minut. Podgrzej do wrzenia, aby całkowicie się rozpuścił. Podawać od 3 do 4 ml w probówkach i sterylizować w autoklawie w 121 ° C przez 15 minut.
Odwodniona pożywka hodowlana ma kolor beżowy, a przygotowana pożywka ma kolor jasnobursztynowy..
Końcowe pH pożywki wynosi 6,9 ± 0,2.
Odważyć 5 g α-naftolu i rozpuścić w 50 ml alkoholu etylowego (absolutnego). Następnie kontynuuj dodawanie alkoholu etylowego, aż osiągnie 100 ml..
Odważyć 40 g wodorotlenku potasu i rozpuścić w zlewce w 50 ml wody destylowanej. Szklankę należy umieścić w zimnej kąpieli wodnej w celu kontrolowania temperatury, ponieważ po rozpuszczeniu preparatu temperatura gwałtownie rośnie.
Po ostygnięciu roztworu przenosi się go do kolby miarowej i uzupełnia do 100 ml wodą destylowaną..
W celu wykonania testu Voges-Proskauer, bulion RM / VP jest zaszczepiany badanym mikroorganizmem z czystej kultury przez 18 do 24 godzin..
Inokulum nie powinno być bardzo gęste. Inkubuje się go w temperaturze 35–37 ° C przez 24–48 godzin, chociaż czasami konieczna jest inkubacja przez kilka dni. Cowan i Steel uważają, że 5 dni to minimalny czas inkubacji niezbędny do wykrycia wszystkich pozytywnych gatunków Voges-Proskauer (VP) z rodziny Enterobacteriaceae..
Oddzielić 1 ml podwielokrotność do probówki i rozwinąć w następujący sposób: Umieścić 12 kropli (0,6 ml) odczynnika Voges A i 4 krople (0,2 ml) Voges B. Wymieszać, aby napowietrzać i pozostawić na 5–10 minut przed interpretacją. Jeśli jednak wynik testu jest nadal negatywny, należy odstawić go i obserwować probówkę po 30 minutach do 1 godziny..
Pojawienie się różowawo-czerwonego koloru wskazuje, że reakcja Vogesa-Proskauera jest pozytywna. Jeśli pożywka pozostaje żółta, reakcja jest negatywna.
Dodawanie programistów w podanej kolejności i ilości jest niezbędne, aby uniknąć fałszywych wyników negatywnych..
Test Voges-Proskauer jest przydatny do rozróżniania szczepów E coli które są VP ujemne, między innymi z rodzajów Klebsiella, Enterobacter, Serratia, które są VP dodatnie.
Do badania jakości przygotowanej pożywki można użyć szczepów kontrolnych, w tym Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium i Enterobacter cloacae ATCC 13047.
Oczekiwane rezultaty to tylko pozytywne reakcje Vogesa-Proskauera K. pneumoniae Y E. cloacae. Reszta daje negatywne reakcje.
Jeszcze bez komentarzy