Plik endonukleazy są to enzymy, które przecinają wiązania fosfodiestrowe znajdujące się wewnątrz łańcucha nukleotydowego. Miejsca restrykcyjne dla endonukleaz są bardzo zróżnicowane. Niektóre z tych enzymów przecinają DNA (kwas dezoksyrybonukleinowy, nasz materiał genetyczny) prawie wszędzie, to znaczy są niespecyficzne.
W przeciwieństwie do tego istnieje inna grupa endonukleaz, które są bardzo specyficzne w regionie lub sekwencji, którą mają przeciąć. Ta grupa enzymów jest znana jako enzymy restrykcyjne i są bardzo przydatne w biologii molekularnej. W tej grupie mamy dobrze znane enzymy Bam HI, Eco RI i Alu I.
W przeciwieństwie do endonukleaz istnieje inny typ białek katalitycznych - egzonukleazy - które są odpowiedzialne za zrywanie wiązań fosfodiestrowych na końcu łańcucha.
Indeks artykułów
Endonukleazy restrykcyjne lub enzymy restrykcyjne to białka katalityczne, które są odpowiedzialne za rozszczepianie wiązań fosfodiestrowych wewnątrz łańcucha DNA w bardzo specyficznych sekwencjach.
Enzymy te można kupić od wielu firm biotechnologicznych, a ich zastosowanie jest prawie niezbędne w ramach obecnych technik manipulacji DNA..
Endonukleazy restrykcyjne nazywane są przy użyciu pierwszych liter dwumianowej nazwy naukowej organizmu, z którego pochodzą, następnie szczepu (jest to opcjonalne) i kończąc na grupie enzymów restrykcyjnych, do której należą. Na przykład Bam HI i Eco RI są szeroko stosowanymi endonukleazami..
Region DNA, który rozpoznaje enzym, nazywany jest miejscem restrykcyjnym i jest unikalny dla każdej endonukleazy, chociaż kilka enzymów może pokrywać się w miejscach restrykcyjnych. To miejsce ogólnie składa się z krótkiej sekwencji palindromicznej o długości około 4 do 6 par zasad, takiej jak AGCT (dla Alu I) i GAATTC dla Eco RI..
Sekwencje palindromiczne to sekwencje, które, chociaż czytane w kierunku od 5 'do 3' lub 3 'do 5', są identyczne. Na przykład w przypadku Eco RI sekwencja palindromiczna to: GAATTC i CTTAAG.
Na szczęście dla biologów molekularnych bakterie rozwinęły w toku ewolucji serię endonukleaz restrykcyjnych, które wewnętrznie fragmentują materiał genetyczny.
W naturze enzymy te wyewoluowały - przypuszczalnie - jako system ochrony bakterii przed inwazją obcych cząsteczek DNA, takich jak te z fagów.
W celu rozróżnienia między rodzimym i obcym materiałem genetycznym te endonukleazy restrykcyjne mogą rozpoznawać określone sekwencje nukleotydowe. Zatem DNA, które nie ma tej sekwencji, może pozostać niezakłócone wewnątrz bakterii..
W przeciwieństwie do tego, gdy endonukleaza rozpoznaje miejsce restrykcyjne, wiąże się z DNA i przecina go..
Biolodzy są zainteresowani badaniem materiału genetycznego istot żywych. Jednak DNA składa się z kilku milionów par zasad. Te cząsteczki są niezwykle długie i muszą być analizowane w małych fragmentach..
Aby osiągnąć ten cel, endonukleazy restrykcyjne są włączone do różnych protokołów biologii molekularnej. Na przykład, pojedynczy gen może zostać przechwycony i replikowany w celu późniejszej analizy. Ten proces nazywa się „klonowaniem” genu..
Polimorfizmy długości fragmentów restrykcyjnych odnoszą się do wzoru określonych sekwencji nukleotydowych w DNA, które endonukleazy restrykcyjne są w stanie rozpoznać i przeciąć.
Dzięki specyfice enzymów każdy organizm charakteryzuje się określonym wzorem cięcia w DNA, pochodzącym z fragmentów o różnej długości.
Historycznie, endonukleazy restrykcyjne zostały podzielone na trzy typy enzymów, oznaczone cyframi rzymskimi. Ostatnio opisano czwarty typ endonukleazy.
Najważniejszą cechą endonukleaz typu I jest to, że są to białka złożone z kilku podjednostek. Każda z tych funkcji funkcjonuje jako pojedynczy kompleks białkowy i zwykle ma dwie podjednostki zwane R, dwie M i jedną S..
Część S jest odpowiedzialna za rozpoznawanie miejsca restrykcyjnego w DNA. Z kolei podjednostka R jest niezbędna do rozszczepienia, a M jest odpowiedzialna za katalizowanie reakcji metylacji..
Istnieją cztery podkategorie enzymów typu I, znane pod literami A, B, C i D, które są powszechnie używane. Ta klasyfikacja opiera się na komplementacji genetycznej.
Enzymy typu I były pierwszymi endonukleazami restrykcyjnymi, które zostały odkryte i oczyszczone. Jednak najbardziej przydatne w biologii molekularnej są typy II, które zostaną opisane w następnej sekcji..
Endonukleazy restrykcyjne typu II rozpoznają określone sekwencje DNA i rozszczepiają się w stałej pozycji w pobliżu sekwencji, która wytwarza 5 'fosforany i 3' hydroksy. Zwykle wymagają jonów magnezu (Mgdwa+), ale są takie, które mają znacznie bardziej szczegółowe wymagania.
Strukturalnie mogą występować jako monomery, dimery lub nawet tetramery. Technologia rekombinacji wykorzystuje endonukleazy typu II iz tego powodu scharakteryzowano ponad 3500 enzymów.
Te układy enzymatyczne składają się z dwóch genów, tzw mod Y wołowina, ten kod dla podjednostek, które rozpoznają DNA oraz dla modyfikacji lub ograniczeń. Oba podmiasta są niezbędne do ograniczenia, procesu całkowicie zależnego od hydrolizy ATP..
Aby przeciąć cząsteczkę DNA, enzym musi oddziaływać z dwiema kopiami niepalindromicznej sekwencji rozpoznawanej, a miejsca muszą znajdować się w odwrotnej orientacji na substracie. Rozszczepienie poprzedzone jest translokacją DNA.
Ostatnio zidentyfikowano dodatkową grupę. System składa się z dwóch lub więcej genów, które kodują białka, które rozszczepiają tylko zmodyfikowane sekwencje DNA, metylowaną, hydroksymetylowaną lub hydrometylowaną glukozylową.
Na przykład enzym EckKMcrBC rozpoznaje dwa dinukleotydy o ogólnej postaci RmC; puryna, po której następuje metylowana cytozyna, którą można rozdzielić kilkoma parami zasad - od 40 do prawie 3000. Rozszczepienie zachodzi około 30 par zasad za miejscem rozpoznawanym przez enzym.
Endonukleazy tego typu są również znane jako endonukleazy "naprowadzający na cel”. Enzymy te rozpoznają i przecinają docelową sekwencję DNA w unikalnych miejscach w genomie od 14 do 40 pz.
Enzymy te są często kodowane w intronach i uważa się, że ich funkcja polega na promowaniu poziomego transferu przeciętych sekwencji. Po przecięciu następuje naprawa rozpadu w podwójnej helisie DNA w oparciu o sekwencję komplementarną.
Endonukleaza I of E coli działa jako system obronny przed fagami i pasożytami. Znajduje się głównie między błoną cytoplazmatyczną a ścianą komórkową. Wytwarza dwuniciowe przerwy w obcym DNA, z którym oddziałuje w przestrzeni peryplazmatycznej.
Endonukleazy CRISPR-Cas to enzymy działające na mechanizm obronny wielu typów bakterii. Identyfikują one i wycinają określone sekwencje DNA z atakujących organizmów, którymi są na ogół wirusy.
Niedawno naukowcy z Massachusetts Institute of Technology (MIT) odkryli wysoce precyzyjny system edycji genomu CRISPR-Cas12bm do modyfikacji ludzkich komórek.
Jeszcze bez komentarzy