Plik aktywność enzymatyczna jest to sposób wyrażania ilości enzymu obecnego w danym czasie. Wskazuje ilość substratu przekształconego w produkt w wyniku katalitycznego działania enzymu w jednostce czasu.
Wpływają na nią warunki, w jakich zachodzi reakcja enzymatyczna, dlatego najczęściej odnosi się do temperatury, w której jest mierzona. Ale co to są enzymy? Są biologicznymi katalizatorami, zdolnymi do przyspieszenia reakcji bez przechodzenia nieodwracalnej zmiany w trakcie katalizowanego procesu.
Ogólnie enzymy to białka, z wyjątkiem rybosomów, cząsteczek RNA o aktywności enzymatycznej.
Enzymy zwiększają szybkość reakcji poprzez zmniejszenie bariery energetycznej (energia aktywacji); który musi upłynąć, aby osiągnąć stan przejściowy i w ten sposób zachodzi reakcja.
Cząsteczki substratu, które osiągają stan przejściowy, podlegają zmianom strukturalnym, które prowadzą do powstania cząsteczek produktu. Na podstawie pełnionych funkcji enzymy dzieli się na sześć dużych grup: oksyreduktazy, transferazy, hydrolazy, liazy, izomerazy i ligazy..
Na przykład enzymy bromelaina i papaina są enzymami proteolitycznymi (hydrolazami) występującymi odpowiednio w ananasie lub ananasie oraz w papai lub papai..
Wiadomo, że zarówno ananas, jak i papaja ułatwiają proces trawienia, ponieważ działając enzymami proteolitycznymi, które zawierają, pomagają w trawieniu białek pochodzących z mięsa i zbóż..
Indeks artykułów
Jednostka enzymu (IU) to ilość enzymu, która katalizuje przemianę 1 µmola substratu w ciągu jednej minuty.
Następnie Międzynarodowy Układ Jednostek (SI) zdefiniował jednostkę aktywności enzymu jako ilość enzymu, która przekształca 1 mol substratu w produkt na sekundę. Jednostka ta otrzymała imię katal (kat).
1 mol = 106 µmol i 1 minuta = 60 sekund.
Dlatego 1 katal równa się 60106 UI. Ponieważ katal jest dużą jednostką, często stosuje się mniejsze jednostki, takie jak: mikrokatal (µkat), 10-6 katal i nanokatal (πkat), 10-9 katal.
Jest to liczba jednostek aktywności enzymu podzielona przez miligramy białka w badanej próbce. Specyficzna aktywność jest bezpośrednio związana ze stopniem oczyszczenia enzymu.
Istnieje kilka metod określania aktywności enzymu. Wybór konkretnej metody będzie zależał od celu testu enzymatycznego; możliwość zastosowania metody; dostęp do sprzętu niezbędnego do przeprowadzenia eksperymentu; koszt użycia określonej metody itp..
Istnieją metody spektrofotometryczne, fluorometryczne, chemiluminescencyjne, kalorymetryczne, radiometryczne i chromatograficzne..
Metody spektrofotometryczne mogą być kolorymetryczne i odczytywane w obszarze ultrafioletu (UV) promieniowania elektromagnetycznego..
Opiera się na wytwarzaniu chromoforu w wyniku działania enzymatycznego. Aktywność enzymatyczną można śledzić w sposób ciągły lub nieciągły.
W postaci ciągłej odczynniki umieszcza się w kuwecie w spektrofotometrze na żądanej długości fali, która odpowiada tej, przy której chromofor ma swoją maksymalną wartość gęstości optycznej; a ponadto nie ma interferencji z inną substancją, która może zostać wygenerowana.
Reakcja enzymatyczna jest inicjowana przez dodanie próbki zawierającej enzym, którego aktywność ma być określona. Równocześnie uruchamia się stoper i od czasu do czasu zapisuje wartość gęstości optycznej..
Ponieważ znana jest równoważność gęstości optycznej z molami substratu lub produktem działania enzymatycznego, w zależności od zastosowanej techniki, można obliczyć liczbę moli zużytego substratu lub wytworzonych moli..
Ponadto, ponieważ zmierzono czas reakcji enzymatycznej, który upłynął, można uzyskać liczbę moli zużytych lub wyprodukowanych na sekundę. W ten sposób aktywność enzymatyczna jest ustalana w jednostkach katalowych.
W partii do oznaczania aktywności enzymatycznej probówki ze składnikami reakcji, z wyjątkiem próbki zawierającej enzym lub inny składnik, umieszcza się w kąpieli o temperaturze 37 ° C. Następnie reakcja rozpoczyna się od dodania brakującego składnika..
Czas wskazany przez technikę może nastąpić, a reakcję kończy się przez dodanie związku, który zatrzymuje reakcję. W tym momencie odczytywana jest gęstość optyczna i ostatecznie przebiega w ten sam sposób jak w sposób ciągły w celu określenia aktywności enzymatycznej..
Na przykład koenzym nikotynoaminukleotyd ma dwie formy: NADH (zredukowany) i NAD+ (zardzewiały). Podobnie, koenzym fosforan nikotynoamitynukleotydu ma dwie formy NADPH i NADP+, odpowiednio zredukowane i utlenione.
Zarówno zredukowane, jak i utlenione formy koenzymu odczytuje się przy długości 260 nm ze światła ultrafioletowego; w międzyczasie tylko formy zredukowane są odczytywane przy długości 340 nm ze światła ultrafioletowego.
Dlatego zarówno w reakcjach utleniania, jak i redukcji, w których uczestniczą wymienione koenzymy, odczytuje się je przy 340 nm.
Zasadniczo oznaczanie aktywności enzymatycznej jest takie samo, jak w przypadku metody kolorymetrycznej w sposób ciągły; z wyjątkiem tego, że gęstość optyczną odczytuje się przy 340 nm, aby obserwować wytwarzanie NADH lub NADPH lub mierzyć zużycie tych koenzymów.
Będzie to zależeć od tego, czy mierzona reakcja to utlenianie czy redukcja. Za pomocą zgodności między gęstością optyczną a liczbą moli NADH i NADPH, w zależności od przypadku, aktywność enzymatyczną można obliczyć, dzieląc liczbę moli koenzymu przez upływający czas w sekundach.
Wraz ze wzrostem stężenia substratu wzrasta aktywność enzymu. Ale przy pewnym stężeniu substratu miejsce aktywne lub miejsca aktywne enzymu są nasycone, więc aktywność enzymu staje się stała..
Jednak produkt działania enzymatycznego może również oddziaływać z miejscami aktywnymi enzymu, powodując zahamowanie aktywności enzymatycznej..
Produkt może działać jako inhibitor konkurencji; na przykład można wymienić enzym heksokinazę. Enzym ten wytwarza fosforylację glukozo-6-fosforanu pochodzącego z glukozy, związku, który po akumulacji hamuje heksokinazę.
Może się zdarzyć, że grupa enzymów (A, B, C, D, E i F) działa sekwencyjnie na szlaku metabolicznym. Enzym B wykorzystuje produkt enzymu A jako substrat i tak dalej.
Komórka, w zależności od swoich wymagań metabolicznych, może aktywować lub hamować sekwencje aktywności enzymatycznej. Na przykład nagromadzenie produktu enzymu F może działać poprzez hamowanie enzymu A lub dowolnego innego enzymu z sekwencji.
Enzym może składać się z kilku podjednostek, z których każda ma odpowiednie miejsca aktywne. Ale te podjednostki nie działają niezależnie, więc aktywność jednej z podjednostek może aktywować lub hamować działanie pozostałych..
Chociaż hemoglobina nie jest uważana za enzym, jest wspaniałym modelem zjawiska allosteryzmu. Hemoglobina składa się z czterech łańcuchów białkowych, dwóch łańcuchów α i dwóch łańcuchów β, z których każdy jest połączony z grupą hemową..
Pomiędzy podjednostkami mogą wystąpić dwa zjawiska: homoalosteryzm i heteroalosteryzm.
Wiązanie substratu do jednej z podjednostek zwiększa powinowactwo pozostałych podjednostek do substratu, co z kolei zwiększa aktywność enzymatyczną każdej z pozostałych podjednostek..
Podobnie hamowanie aktywności enzymatycznej w jednej z podjednostek wywołuje ten sam efekt w pozostałych..
W przypadku hemoglobiny wiązanie tlenu z grupą hemową jednego z łańcuchów białkowych spowoduje wzrost zachłanności tlenu w pozostałych łańcuchach..
Podobnie uwolnienie tlenu z grupy hemu powoduje uwolnienie tlenu z pozostałych grup łańcuchów białkowych..
Wiązanie się substancji aktywującej lub hamującej, innej niż substrat, do jednej z podjednostek spowoduje aktywację lub zahamowanie aktywności enzymatycznej w innych podjednostkach.
W przypadku hemoglobiny wiązanie z grupą hemową H.+, WSPÓŁdwa i 2,3-difosfoglicerynian do jednej z podjednostek, zmniejsza powinowactwo grupy hemowej do tlenu, powodując jego uwalnianie. To uwalnianie tlenu jest również wytwarzane w innych łańcuchach hemoglobiny.
Wraz ze wzrostem stężenia substratu rośnie aktywność enzymu. Wynika to ze zwiększonego dostępu cząsteczek substratu do miejsc aktywnych enzymu..
Jednak przy danym stężeniu substratu wszystkie miejsca aktywne enzymu są nim nasycone, co powoduje, że aktywność enzymatyczna nie wzrasta, nawet jeśli stężenie substratu jest zwiększone..
Enzymy mają optymalne pH, przy którym powinowactwo enzymu do substratu jest najwyższe. Przy tym pH osiąga się maksymalną wartość aktywności enzymatycznej.
Nadmierna kwasowość lub zasadowość pożywki może powodować denaturację enzymu, a tym samym zmniejszenie jego aktywności..
Profil pH aktywności enzymów jest zróżnicowany. Tak więc, na przykład, pepsyna ma maksymalną aktywność pomiędzy 1-2 jednostkami pH; trypsyna ma optymalne pH 8; a papaina ma stałą aktywność w zakresie pH od 4 do 8.
Aktywność enzymatyczna wzrasta wraz ze wzrostem temperatury. Ogólnie rzecz biorąc, aktywność enzymatyczna podwaja się na każde 10 stopni wzrostu, aż do osiągnięcia temperatury optymalnej dla aktywności enzymu..
Jednak po przekroczeniu optymalnej temperatury aktywność enzymu ma tendencję do zmniejszania się wraz ze wzrostem temperatury reakcji. Wynika to z faktu, że białka, a więc i enzymy, ulegają denaturacji w wyniku nadmiernego wzrostu temperatury..
Ogólnie enzymy mają optymalną aktywność w zakresie stężeń od 0 do 500 mmol / l. Jednak przy wyższych stężeniach aktywność enzymatyczna ma tendencję do spadku.
W tych okolicznościach pewne interakcje jonowe w enzymach, niezbędne dla ich maksymalnej aktywności, są blokowane..
Jeszcze bez komentarzy