Plik bulion mocznikowy Jest to płynna pożywka hodowlana, używana do wykazania obecności enzymu ureazy w niektórych mikroorganizmach. Ureaza jest enzymem drobnoustrojowym, który jest wytwarzany w sposób konstytutywny, to znaczy jest syntetyzowany niezależnie od tego, czy obecny jest substrat, na który oddziałuje..
Funkcja ureazy jest związana z rozkładem związków organicznych. Nie wszystkie mikroorganizmy są zdolne do syntezy tego enzymu, dlatego jego oznaczenie laboratoryjne pozwala na identyfikację określonych szczepów bakterii, a nawet rozróżnienie gatunków z tego samego rodzaju..
Istnieją dwa rodzaje testów mocznika: Stuart i Christensen. Różnią się składem i wrażliwością. Pierwsza jest szczególna, ponieważ pokazuje dużą ilość ureazy wytwarzanej przez gatunki z rodzaju Proteus.
Drugi jest bardziej czuły i może wykryć niewielkie ilości ureazy wytwarzanej późno przez inne rodzaje bakterii, takie jak Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus, Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus, Helicobacter i Mycobacterium.
Bulion mocznikowy Stuarta składa się z mocznika, chlorku sodu, fosforanu dwupotasowego, fosforanu monopotasu, ekstraktu drożdżowego, czerwieni fenolowej i wody destylowanej.
W międzyczasie bulion mocznikowy lub agar Christensena składa się z peptonów, chlorku sodu, fosforanu potasu, glukozy, mocznika, czerwieni fenolowej, wody destylowanej i agaru. Ta ostatnia tylko wtedy, gdy jest to medium stałe.
Indeks artykułów
Enzym ureaza hydrolizuje mocznik, tworząc dwutlenek węgla, wodę i dwie cząsteczki amoniaku. Związki te reagują, tworząc produkt końcowy zwany węglanem amonu..
Pożywka Stuart's Urea Broth jest bardziej buforowana i ma pH 6,8. Dlatego mikroorganizm musi być w stanie wytworzyć duże ilości amoniaku, aby zmienić kolor na czerwony fenol. PH powinno wzrosnąć powyżej 8.
Dlatego bulion mocznikowy Stuarta jest selektywny dla gatunków Proteus, dając pozytywne wyniki w ciągu 24 do 48 godzin od inkubacji i nie jest skuteczny w przypadku bakterii wytwarzających małe ilości ureazy lub wolno hydrolizujących mocznik..
Dzieje się tak, ponieważ gatunki Proteus mogą wykorzystywać mocznik jako źródło azotu. Zamiast tego inne bakterie wytwarzające ureazę potrzebują dodatkowego źródła.
Jednak Pérez i wsp. (2002) ustalili, że bulion mocznikowy Stuarta był tak samo skuteczny jak agar mocznikowy Christensena w oznaczaniu ureazy w szczepach drożdży z rodzajów Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon i Saccharomyces.
Autorzy badania twierdzą, że osiągnęli 100% zgodność z obydwoma mediami (Stuart i Christensen) podczas inkubacji przez 24 i 48 godzin; z wyjątkiem, że szczepy, którym udało się zmienić pożywkę na mocny różowo-fuksjowy kolor, uznano za pozytywne.
To wyjaśnienie jest konieczne, ponieważ Lodder (1970) stwierdził, że prawie wszystkim drożdżom udaje się zmienić fazę agaru mocznikowego Christensena na bladoróżowy. Wynika to z faktu, że mogą hydrolizować mocznik w niewielkich ilościach oraz z powodu tworzenia się amin w wyniku oksydacyjnej dekarboksylacji aminokwasów na powierzchni. Nie należy tego interpretować jako pozytywnego.
Bulion mocznikowy lub agar Christensena są mniej zbuforowane, dzięki czemu są w stanie wykryć niewielkie ilości amoniaku. Ponadto podłoże to jest wzbogacone w peptony i glukozę. Związki te powodują wzrost innych mikroorganizmów wytwarzających ureazę, które nie rosną w bulionie Stuarta..
Podobnie, test mocznika Christensena zapewnia szybsze wyniki, szczególnie w przypadku Proteusa, będąc w stanie dać silnie dodatni wynik w zaledwie 30 minut jako minimalny czas i do 6 godzin jako maksymalny czas.
Reszta mikroorganizmów wytwarzających ureazę jest w stanie nieznacznie zmienić kolor pożywki po 6 godzinach, a silnie po 24, 48, 72 godzinach lub dłużej, a nawet niektóre szczepy mogą reagować słabo po 5 lub 6 dniach.
Podłoże jest pierwotnie koloru żółto-pomarańczowego, a pozytywna reakcja zmieni kolor podłoża na różowo-fuksjowy. Intensywność koloru jest wprost proporcjonalna do ilości wytworzonego amoniaku.
Ujemna reakcja pozostawi podłoże w pierwotnym kolorze, z wyjątkiem drożdży, które mogą stać się bladoróżowe na podłożu agarowym Christensena z mocznikiem..
Zważyć potrzebne gramy zgodnie ze wskazówkami firmy handlowej. Rozpuścić w najlepiej sterylnej wodzie destylowanej. Nie używaj ciepła do rozpuszczenia, ponieważ mocznik jest wrażliwy na ciepło.
Do sterylizacji stosowana jest metoda filtracji membranowej. W tym celu stosuje się filtr Millipore z porami o średnicy 0,45 µ. Nie używać autoklawu. Po przefiltrowaniu roztworu rozprowadza się go do sterylnych probówek. Aby uzyskać wiarygodne wyniki, należy przenieść między 1,5 ml jako minimalną ilość a 3 ml jako maksymalną ilość na probówkę..
Przed użyciem przechowywać w lodówce i ogrzać..
Jeśli metoda filtracji nie jest dostępna, pożywkę należy natychmiast zużyć, aby uzyskać wiarygodne wyniki..
Inny sposób przygotowania bulionu mocznikowego Stuarta jest następujący:
Niektóre domy handlowe sprzedają podłoże podstawowe do testu mocznika, z wyłączeniem mocznika..
Waży się ilość wskazaną przez firmę handlową. Rozpuszcza się go w wodzie destylowanej i sterylizuje w autoklawie w 121 ° C przez 15 minut. Odstawić na chwilę, a gdy podłoże jest ciepłe, dodać 100 ml roztworu mocznika przygotowanego na 20% i wysterylizowanego przez filtrację..
Jest rozprowadzany w sterylnych probówkach, jak opisano wcześniej.
Odważyć 29 g odwodnionego mocznika i rozpuścić w 100 ml wody destylowanej. Do sterylizacji użyj metody filtracji. Nie autoklawować.
Rozpuścić 24 g odwodnionego podstawowego agaru w 950 ml wody destylowanej. Sterylizuj w autoklawie w 121 ° C przez 15 minut. Odstawić, aż osiągnie temperaturę 50 ° C i dodać aseptycznie przygotowany wcześniej mocznik.
Wlać 4 do 5 ml do sterylnych probówek i przechylić do zestalenia. Powinien być długi dziób typu flet.
Pożywka ta może być również przygotowana w postaci płynnej.
Test mocznika jest niezwykle skuteczny w rozróżnianiu rodzaju Proteus od innych rodzajów z rodziny Enterobacteriaceae, biorąc pod uwagę szybką reakcję zapewnianą przez Proteus..
Wykorzystując kompozycję Christensena, test pomaga rozróżnić gatunki tego samego rodzaju. Na przykład, S. haemolyticus i S. warneri sna Staphylococcus koagulazo-ujemne i beta-hemolityczne, ale różnią się tym S. haemolyticus jest mocznik-ujemny i S. warneri jest mocznikiem dodatnim.
Z drugiej strony McNulty z powodzeniem użył 2% bulionu mocznikowego Christensena do badania obecności Helicobacter pylori w biopsjach pobranych z błony śluzowej żołądka (okolica antralna).
Obecność H. pylori świadczy o tym pozytywny wynik testu na mocznik. Czas obserwacji wyników jest wprost proporcjonalny do ilości obecnych mikroorganizmów.
Jak widać, jest to prosta metoda diagnozy Helicobacter pylori w biopsjach żołądka.
Wreszcie test ten jest również przydatny do różnicowania gatunków z rodzajów Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus i Mycobacteria..
Obie metody wymagają silnego inokulum mikrobiologicznego, aby zoptymalizować wyniki. Kolonie bakterii najlepiej pobierać z agaru z krwią, a drożdże z agaru Sabouraud, z kilkoma wyjątkami. Inokulum jest emulgowane w ciekłym medium.
W przypadku bulionu mocznikowego Stuarta inkubuj w temperaturze 37 ° C przez 24 do 48 godzin, wiedząc, że szukasz szczepów z rodzaju Proteus tylko wtedy, gdy szczepem jest bakteria. W przypadku drożdży można go inkubować w temperaturze 37 ° C lub w temperaturze pokojowej przez 24–48 godzin inkubacji.
W przypadku bulionu mocznikowego Christensena inkubuje się go w 37ºC przez 24 godziny. Jeśli wynik testu jest negatywny, można go inkubować do 6 dni. Pozytywny wynik testu przed upływem 6 godzin oznacza, że jest to szczep z rodzaju Proteus.
W przypadku agaru mocznikowego Christensena, fazę agaru zaszczepia się silnie, bez nakłuwania. Bulion jest inkubowany i interpretowany w ten sam sposób.
Szczepy kontrolne, takie jak Proteus mirabilis ATCC 43071, Klebsiella pneumoniae ATCC 7006003, Escherichia coli ATCC 25922 i Salmonella typhimurium. Pierwsze dwa powinny dać wyniki pozytywne, a dwa ostatnie wyniki negatywne..
Jeszcze bez komentarzy