Plik rozmaz bakteryjny jest cienkowarstwowym przedłużeniem zawiesiny mikroorganizmów bakteryjnych, wykonanym na przezroczystej szklanej płytce lub szkiełku, do obserwacji pod mikroskopem optycznym.
Przedłużenie w postaci folii przeprowadza się w celu jak największego oddzielenia mikroorganizmów, ponieważ jeśli są zgrupowane, obserwacja nie jest jasna.
W badaniu kultur bakteryjnych do ich lepszej analizy stosuje się techniki przygotowania rozmazów, utrwalania i barwienia. Ze względu na mały rozmiar mikroorganizmów do ich obserwacji koniecznie jest użycie mikroskopu optycznego..
Mikroskopy optyczne są niezbędnymi przyrządami do obserwacji rozmazów. Wykorzystują one soczewki optyczne i światło umożliwiające oglądanie próbek z dużym powiększeniem..
Generalnie, żywe komórki nie mają przeważnie kolorowych struktur, widziane pod mikroskopem świetlnym są bezbarwnymi, przezroczystymi próbkami i wykazują bardzo mały kontrast wewnętrzny oraz ich otoczenie..
Obserwacja za pomocą prostego mikroskopu optycznego z jasnym polem, bez użycia pomocniczych technik barwienia, jest bardzo ograniczona i jest stosowana tylko w niektórych przypadkach, takich jak obserwacja ruchu mikroorganizmów.
Aby zapewnić optymalną obserwację mikroorganizmów, należy zachować równowagę między kontrastem a rozdzielczością. Szczegółów komórek nie można zobaczyć pod mikroskopem, nawet przy wysokiej rozdzielczości; zastosowanie barwników jest wymagane w przypadku technik barwienia, które zapewniają kontrast do obserwacji.
Indeks artykułów
Aby osiągnąć doskonały kontrast, istnieją wyrafinowane mikroskopy tzw mikroskop z kontrastem fazowym, mikroskop różnicowy z interferencją i mikroskop z ciemnym polem. Ten typ mikroskopu służy m.in. do obserwacji struktur bakteryjnych, takich jak osłonki i włókna..
Barwienie to prosta technika zwiększania kontrastu, którą uzyskuje się za pomocą mikroskopu w jasnym polu. W tej technice można zastosować różne barwniki, które znacznie poprawiają obserwację mikroskopową..
Bejce wykonuje się bezpośrednio na rozmazach lub przedłużeniach zawiesin mikroorganizmów na szkiełkach, uprzednio wysuszonych i utrwalonych..
Utrwalanie to technika stosowana w celu zachowania struktur komórkowych; powoduje inaktywację mikroorganizmów i przyleganie do szkiełka szkiełka. Istnieją różne metody utrwalania: utrwalanie na gorąco i utrwalanie chemiczne.
Jest to najczęściej stosowana metoda obserwacji rozmazów bakteryjnych. Technika polega na przepuszczeniu zawiesiny bakteryjnej rozmazu przez płomień zapalniczki. Ta technika jest w stanie zachować zewnętrzną morfologię bakterii, ale niszczy ich wewnętrzne struktury..
Utrwalanie chemiczne wykorzystuje środki konserwujące, takie jak między innymi formaldehyd lub formaldehyd, etanol i kwas octowy. Zaletą stosowania chemicznych środków utrwalających jest to, że uzyskuje się zachowanie wewnętrznej struktury komórkowej mikroorganizmów..
Najczęstsze procedury barwienia uprzednio wysuszonego i utrwalonego rozmazu to barwienie pozytywne lub proste, barwienie różnicowe i barwienie negatywne. Istnieją również specjalne techniki barwienia poszczególnych struktur komórkowych (torebka, zarodniki, wici).
Barwienie pozytywne lub proste jest najczęściej stosowaną techniką barwienia wymazów. Wykorzystuje barwniki, które mają zdolność wiązania się z określonymi strukturami drobnoustrojów, co pozwala na ich obserwację pod mikroskopem.
Barwniki te mają w swojej strukturze chemicznej grupy chromoforowe (część barwną) z naprzemiennymi wiązaniami podwójnymi i pojedynczymi (koniugacja). Te wiązania mogą z kolei tworzyć wiązania jonowe lub kowalencyjne z niektórymi strukturami komórkowymi..
Barwniki stosowane w barwieniu pozytywnym lub prostym są w większości pochodnymi chemicznymi anilina (kolorowe sole organiczne).
Z drugiej strony wśród barwników możemy znaleźć niektóre o pH zasadowym, a inne o pH kwaśnym..
W barwnikach podstawowych grupa chromoforowa ma dodatni ładunek elektryczny. Zdecydowana większość mikroorganizmów prokariotycznych ma obojętne wewnętrzne pH, a ich powierzchnia komórkowa jest naładowana ujemnie. W wyniku tego oddziaływania elektrostatycznego chromofor wiąże się z komórką i zabarwia ją.
Przykładami podstawowych barwników są między innymi błękit metylenowy, fiolet krystaliczny, zieleń malachitowa, podstawowa fuscyna, safranina..
W barwnikach kwasowych grupa chromoforowa ma ujemny ładunek elektryczny. Są one używane do barwienia białek z dodatnio naładowanymi grupami aminowymi. Przykładami barwników kwasowych są kwaśna fuscyna, róż bengalski, czerwień Kongo i eozyna.
Technika barwienia różnicowego polega na nałożeniu dwóch barwników o różnej barwie lub intensywności w celu rozróżnienia różnych mikroorganizmów pod mikroskopem. Barwienie metodą Grama i barwienie odporne na kwasy i alkohole to najczęściej stosowane barwienia różnicujące w bakteriologii.
Barwienie metodą Grama jest stosowane jako badanie wstępne w celu poznania kształtu, rozmiaru, grupowania komórek, a także rodzaju ściany komórkowej. Za pomocą testu barwienia Grama bakterie ściany komórkowej klasyfikuje się na bakterie Gram-dodatnie i bakterie Gram-ujemne..
W tej technice stosuje się barwniki chemiczne, które nie wnikają do wnętrza komórki, ale sprawiają, że pożywka, w której mikroorganizmy występują, pojawia się jako czarne tło..
W technice barwienia negatywowego rozmaz wykonywany jest za pomocą kropli tuszu indyjskiego lub zawiesiny nigrozyny, które po wysuszeniu w temperaturze pokojowej tworzą film nieprzezroczysty dla przenikania światła. W ten sposób mikroorganizmy są postrzegane jako jasne kształty na ciemnym tle..
1.- Umyj szkiełka bardzo dobrze, osusz papierem chłonnym i opisz je. Etykieta musi wskazywać zawartość preparatu, datę i nazwisko osoby, która go przetworzyła..
2.- Zapal zapalniczkę i wysterylizuj pętlę inokulacyjną w płomieniu, aż będzie jaskrawoczerwona.
3.- Poczekaj, aż uchwyt ostygnie.
4.- Weź probówkę do hodowli bakterii, zdejmij nasadkę i szybko przeciągnij wlot probówki w pobliżu płomienia palnika (płomień).
5.- Wprowadzić pętlę inokulacyjną do probówki zawierającej kulturę bakteryjną i pobrać próbkę.
6.- Jeśli hodowla jest w płynnej pożywce, umieść próbkę pobraną rączką na środku szkiełka i rozłóż ją ostrożnie w kółko o średnicy około 2 cm..
7.- Ponownie wysterylizuj pętlę inokulacyjną.
8.- Pozostawić rozmaz do wyschnięcia na powietrzu.
9. - Powtórz kroki od 3 do 8 trzy razy.
10.- Jeśli kultura jest na stałym podłożu, wcześniej na szkiełku należy umieścić kroplę wody destylowanej. Odbywa się to w celu zmieszania małej próbki kultury pobranej z pętlą inokulacyjną, zgodnie z instrukcjami w krokach 2 do 5 (warunki aseptyczne).
11.- Rozprowadzić rozcieńczoną próbkę kroplą wody na szkiełku i powtórzyć trzykrotnie.
1.- Dodać dwie krople metanolu lub absolutnego etanolu do suchego rozmazu z kultur w płynnej pożywce..
2.- Pozostawić do wyschnięcia na powietrzu z dala od zapalniczki.
3.- Jeśli rozmaz pochodzi z hodowli na stałym podłożu, suchy rozmaz jest utrwalany ciepłem, przepuszczając go 2 do 3 razy szybko przez najgorętszą część jaśniejszego płomienia..
4.- Dotknij dolną część mazi grzbietową częścią lewej ręki (dla praworęcznych; w przeciwnym razie użyj prawej ręki) i sprawdź, czy jest zimna.
1. - Dodać 2 krople wybranej plamy do rozmazu i pozostawić na czas wymagany w określonych protokołach dla każdej plamy (zwykle od 1 do 5 minut).
2.- Niektóre plamy wymagają użycia ciepła do ich aktywacji, w takim przypadku należy bardzo uważać podczas podgrzewania szkiełka w jaśniejszym płomieniu (manipulować nim pęsetą i unikać wrzenia). Przegrzanie rozmazu może zniszczyć obserwowane komórki..
3.- Usuń nadmiar barwnika, przemywając go wodą destylowaną z piketki. Usunąć wodę myjącą delikatnie stukając szkiełkiem w jego krawędź, przechyloną na stole roboczym.
4. - Pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.
5.- W zależności od rodzaju obserwacji na tym etapie stosuje się szkiełko nakrywkowe lub nie. Szkiełko nakrywkowe chroni i konserwuje rozmaz. Jeśli na tym etapie wykonuje się obserwację immersji w olejku, nie używa się szkiełek nakrywkowych, ale rozmaz nie może zostać zachowany.
1. - Zanurz rozmaz kolejno w każdym z roztworów wskazanych poniżej, na minimum 5 minut. Celem tych „kąpieli” jest całkowite odwodnienie rozmazu. Każdy odczynnik należy dobrze osuszyć przed wprowadzeniem rozmazu do kolejnej kąpieli..
Kolejność kąpieli odwadniających jest następująca:
Następnie pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
2.- Zamocować szkiełko nakrywkowe, najlepiej 22 × 22 mm, używając balsamu kanadyjskiego lub innego środka mocującego.
Jeszcze bez komentarzy