Plik pół MIO to test biochemiczny pomocny w identyfikacji gatunków bakterii z rodziny Enterobacteriaceae. Jest dość pożywny i składa się z glukozy, ekstraktu drożdżowego, peptonu, tripteiny, chlorowodorku L-ornityny, purpury bromokrezolowej i agaru.
Znaczenie jego akronimu (MIO) opisuje każdy z parametrów, które można zaobserwować na tym medium; ruchliwość, indol i ornityna. Ruchliwość to zdolność mikroorganizmu do poruszania się z powodu obecności wici. Aby ta właściwość była zachowana, konsystencja podłoża musi być półstała, więc preparat zawiera mniej agaru..
Produkcja indolu wskazuje na obecność enzymu tryptofanazy, który działa na aminokwas tryptofan, co wymaga użycia odczynnika ujawniającego, aby produkcja indolu była widoczna..
Wreszcie ornityna określa, czy bakteria jest w stanie dekarboksylować aminokwas, to znaczy, czy ma enzym dekarboksylazę ornityny.
Indeks artykułów
Te pierwiastki przyczyniają się do wartości odżywczej tego podłoża. Stanowią źródło składników odżywczych i aminokwasów niezbędnych do rozwoju bakterii.
Ponadto tryptofan jest źródłem tryptofanu, który wykazuje obecność enzymu tryptofanazy, który rozkłada tryptofan poprzez redukcyjną deaminację, uwalniając indol, kwas pirogronowy, amoniak i energię..
Indol jest bezbarwny, dlatego jego obecność uwidacznia się po dodaniu pięciu kropli odczynnika Ehrlicha lub Kovacsa, oba z p-dimetyloaminobenzaldehydem..
Grupa aldehydowa tego związku reaguje z indolem, tworząc na powierzchni agaru produkt w kolorze fuksji o kształcie pierścienia..
Każdy ślad koloru należy uznać za wynik pozytywny. Próbę należy odczytać natychmiast, ponieważ z biegiem czasu kolor ulega degradacji.
Ponadto test ten powinien zostać ujawniony po zanotowaniu wyników ruchliwości i dekarboksylacji ornityny..
Wynik pozytywny: tworzenie się pierścienia w kolorze fuksji podczas dodawania kropli odczynnika Kovacsa.
Test negatywny: brak tworzenia pierścieni.
Zdolność bakterii do poruszania się zostanie potwierdzona, jeśli zaobserwuje się mętne podłoże lub jeśli wokół początkowej inokulacji pojawi się gruba linia wzrostu..
Negatywny test ruchliwości zostanie udowodniony przez obserwację cienkiej linii wzrostu, a wszystko wokół niego będzie bez wzrostu..
Ważne jest, aby odczytać ruchliwość przed ujawnieniem indolu, ponieważ dodanie odczynnika powoduje zmętnienie całego podłoża..
W mobilnych, ale wolno rosnących bakteriach trudno jest wykazać ich ruchliwość za pomocą tego podłoża. W takim przypadku zaleca się zastosowanie innych testów lub metod, takich jak metoda pomiaru ruchomości medium lub metoda drop-tending..
Glukoza jest węglowodanem ulegającym fermentacji, który oprócz dostarczania energii zakwasza środowisko, co jest warunkiem koniecznym do zajścia dekarboksylacji aminokwasu ornityny..
Zawsze musi zachodzić fermentacja glukozy, wychodząc z zasady, że wszystkie bakterie z rodziny Enterobacteriaceae fermentują glukozę..
W przypadku, gdy bakterie wytwarzają enzym dekarboksylazę ornityny, może to działać po zakwaszeniu pożywki w wyniku fermentacji glukozy..
Enzym dekarboksylaza ornityny działa na grupę karboksylową aminokwasu, wytwarzając aminę zwaną putrezyną, która ponownie alkalizuje podłoże.
Ten test należy odczytać po 24 godzinach inkubacji, ponieważ jeśli spróbujesz przeczytać przed, możesz błędnie zinterpretować test z fałszywie ujemnym.
Należy pamiętać, że pierwszą zachodzącą reakcją jest fermentacja glukozy, dlatego pożywka w początkowej fazie (pierwsze 10-12 godzin) żółknie. Jeśli następnie nastąpi dekarboksylacja ornityny, podłoże zmieni kolor na fioletowy.
Ważne jest, aby zinterpretować test dekarboksylacji ornityny przed ujawnieniem indolu, ponieważ dodanie odczynnika Kovacsa modyfikuje kolor pożywki..
Test negatywny: żółte średnie lub żółte tło.
Wynik pozytywny: w połowie całkowicie fioletowy.
W tym przypadku stosuje się purpurę bromokrezolową; osoba odpowiedzialna za ujawnianie, kiedy następuje zmiana pH w pożywce. Po zakwaszeniu wskaźnik zmienia kolor na żółty, a po alkalizacji zmienia kolor na fioletowy.
Aby wysiać pożywkę MIO, stosuje się prostą pętlę lub igłę, a wraz z nią zbiera się część badanej kolonii..
Głębokie nakłucie wykonuje się na środku MIO w linii prostej. Nie zaleca się wykonywania podwójnego nakłucia, ponieważ może dać fałszywy obraz ruchliwości, jeśli nakłucia nie zostaną wykonane w tym samym miejscu.
Inkubować przez 24 do 48 godzin w temperaturze 37 ° C w warunkach tlenowych. Obserwuj wyniki w następującej kolejności: ruchliwość, dekarboksylacja ornityny i wreszcie odkryj indol.
Wskazane jest aseptyczne pobranie 2 ml pożywki, przeniesienie jej do jałowej probówki i wykonanie tam testu indolowego, tak aby w przypadku wyniku ujemnego pozostałą część oryginalnej probówki można było inkubować przez kolejne 24 godziny w celu ujawnienia indol ponownie..
Rozwój indolu przeprowadza się w następujący sposób: 3 do 5 kropli odczynnika Kovacsa dodaje się do pożywki MIO i energicznie wstrząsa. Obserwuje się, czy pojawia się czerwony pierścień w kolorze fuksji.
Odważyć 31 g pożywki MIO i rozpuścić w litrze wody destylowanej..
Podgrzewaj, aż mieszanina zacznie wrzeć przez jedną minutę, często wstrząsając, aż agar całkowicie się rozpuści. Rozprowadzić 4 ml pożywki do probówek 13/100 z bawełnianymi zatyczkami.
Sterylizuj w autoklawie w 121 ° C przez 15 minut. Wyjąć z autoklawu i odstawić prosto na stojak, tak aby powstał półstały blok.
Przechowywać w lodówce 2-8 ° C. Pozostaw do ogrzania przed wysianiem szczepu bakteryjnego.
Odwodnione podłoże ma kolor beżowy, a przygotowanego lekko opalizujący na fioletowo..
Końcowe pH przygotowanej pożywki wynosi 6,5 ± 0,2
Podłoże zmienia kolor na żółty przy kwaśnym pH i jest purpurowy przy zasadowym pH.
Odczynnik przygotowuje się w następujący sposób:
Odmierza się 150 ml alkoholu amylowego, izoamylowego lub butylowego (dowolnego z trzech). Rozpuszcza się w nim 10 g p-dimetyloaminobenzaldehydu. Następnie powoli dodaje się 50 ml stężonego kwasu solnego..
Przygotowany odczynnik jest bezbarwny lub jasnożółty. Powinien być przechowywany w bursztynowej butelce i przechowywany w lodówce. Ciemnobrązowy kolor wskazuje na jego zepsucie.
Odczynnik Ehrlicha można również zastąpić odczynnikiem Kovacsa. Ten ostatni, będąc bardziej wrażliwym, jest preferowany do ujawniania indolu w bakteriach, które wytwarzają go w niewielkich ilościach, takich jak niektóre niefermentujące pałeczki Gram-ujemne i niektóre beztlenowce..
To podłoże jest testem uzupełniającym zestaw testów biochemicznych do identyfikacji bakterii z rodziny Enterobacteriaceae..
Dane dotyczące dekarboksylacji ornityny służą do rozróżnienia Shigella sonnei, co daje pozytywny z Shigella boydii, Shigella flexneri i S. dysenterieae, które dają negatywy.
Odróżnia również rodzaj Klebsiella, który wykazuje wynik negatywny, od rodzaju Enterobacter, w przypadku którego większość jego gatunków daje wynik pozytywny..
Za każdym razem, gdy przygotowywana jest partia pożywki MIO, można przeprowadzić test kontrolny. W tym celu do obserwacji zachowania pożywki wykorzystuje się znane lub certyfikowane szczepy..
Szczepy, które mogą być użyte to Escherichia coli, Morganella morganii, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes Y Proteus mirabilis.
Oczekiwane rezultaty to E. coli i M. morganii. Dan M: +, I: + i O: +.
Klebsiella pneumoniae daje wszystkie negatywne (M: -, I: -, O :-). Proteus mirabilis Y Enterobacter aerogenes dać M: + I: - i O: +.
Jeszcze bez komentarzy