Plik sekwencjonowanie DNA (kwas dezoksyrybonukleinowy) to procedura przeprowadzana w laboratoriach biologii molekularnej, która pozwala poznać kolejność nukleotydów w badanym materiale genetycznym. Ponadto można również ujawnić sekwencjonowanie RNA (kwasu rybonukleinowego).
Ta technika była niezbędna dla rozwoju nauk biologicznych. Ma również zastosowanie w innych dziedzinach wiedzy - na przykład w diagnostyce medycznej i dochodzeniach kryminalistycznych.
Wcześniej sekwencjonowanie nici DNA było uważane za powolną i kosztowną czynność, co pozwoliło na identyfikację tylko kilku par zasad w oligonukleotydach.
Dzisiaj, przy wszystkich postępach w nauce, sekwencjonowanie DNA jest rutynową operacją w wielu laboratoriach na całym świecie dzięki prawie 50-letniemu wkładowi badań w tej dziedzinie. Jeśli chodzi o długość łańcucha, w bardzo krótkim czasie można zsekwencjonować do milionów par zasad.
Aby to zrobić, opracowano dziesiątki technik, które różnią się ceną i precyzją. W tym artykule opiszemy zarówno techniki klasyczne, jak i nowoczesne, z których każda ma swoje zalety i wady..
Do tej pory techniki sekwencjonowania pozwalają na uzyskanie sekwencji całych genomów, od małych prokariotów i drożdży po genom ludzki..
Indeks artykułów
Aby zrozumieć metody i techniki stosowane do sekwencjonowania DNA, konieczne jest poznanie pewnych kluczowych aspektów struktury i składu cząsteczki..
DNA to biocząsteczka występująca we wszystkich żywych organizmach, od bakterii po duże zwierzęta wodne. Organelle - podobnie jak mitochondria i chloroplasty - mają wewnątrz kolistą cząsteczkę DNA. Nawet w przypadku niektórych wirusów znalezionym materiałem genetycznym jest DNA.
Strukturalnie DNA jest zbiorem nukleotydów. Każdy z nich składa się z węglowodanu, zasady azotowej (A, T, C lub G) i grupy fosforanowej. Celem sekwencjonowania DNA jest ujawnienie kolejności, w jakiej cztery zasady azotowe znajdują się w sekwencji..
W połowie lat pięćdziesiątych XX wieku badacze Watson i Crick opisali strukturę DNA za pomocą technik chrystolograficznych. Jednak żadnemu z tych badaczy nie udało się znaleźć sposobu na rozwikłanie tej sekwencji..
Choć istnieli pewni poprzednicy, najważniejszym wydarzeniem było stworzenie metody Sangera w 1977 roku. Ojciec metody Frederick Sanger był brytyjskim biochemikiem, laureatem dwóch nagród Nobla za ogromny wkład w nauki biologiczne..
Technika ta jest również znana w literaturze jako „zakończenie łańcucha” lub dideoksynukleotydy. Zasady tej techniki i te, które zostały opracowane w oparciu o ulepszenia i innowacje tej techniki, zostaną opisane poniżej..
Rozwój metody Sangera był ważnym wydarzeniem w biologii molekularnej. Obejmuje podstawowe składniki procesu replikacji DNA, który normalnie zachodzi w komórce, ale dodaje specjalny składnik: dideoksynukleotydy.
- Polimeraza DNA: enzym polimeraza DNA jest kluczowym elementem procesu. Cząsteczka ta uczestniczy w replikacji nici DNA, a jej rolą jest synteza nowej nici, łącząc trójfosforanowe deoksyrybonukleotydy z komplementarnymi..
Przypomnijmy, że w DNA tyminy (T) łączą się z adeninami (A) poprzez dwa wiązania wodorowe, podczas gdy cytozyna (C) robi to z guaniną (G) przez trzy mostki..
- Nukleotydy: Sekwencjonowanie Sangera obejmuje dwa rodzaje nukleotydów, cztery 2'-deoksynukleotydy (w skrócie dATP, dGTP, dCTP i dTTP) oraz cztery specjalne dideoksynukleotydy (ddATP, ddGTP, ddCTP i ddTTP)..
Chociaż dideoksynukleotydy są podobne do monomerów, które są normalnie włączane do DNA, nie mają w swojej strukturze grupy -OH. Uniemożliwia to dodanie nowego nukleotydu do łańcucha..
Dlatego też, gdy do tworzonego łańcucha dodawany jest specjalny nukleotyd - w sposób całkowicie przypadkowy - synteza zostaje sparaliżowana. W ten sposób pod koniec reakcji powstają łańcuchy o różnej wielkości, z których każdy został zatrzymany w innym punkcie..
Eksperymentalnie przygotowano cztery testy. Każdy zawiera DNA wyekstrahowane z interesującej próbki biologicznej, normalne nukleotydy i jeden z czterech specjalnych typów nukleotydów. Lub specjalne nukleotydy są oznaczone jakimś rodzajem markera fluorescencyjnego (patrz automatyczne sekwencjonowanie poniżej).
Pierwszym krokiem jest oddzielenie każdego z syntetyzowanych łańcuchów według ich rozmiaru. Niektóre będą dłuższe niż inne, w zależności od tego, gdzie zastosowano specjalne bazy..
Istnieją różne techniki biochemiczne, które pozwalają na rozdzielenie składników mieszaniny na podstawie wielkości jako właściwości rozróżniającej. W metodzie Sangera poszczególne łańcuchy rozdziela się metodą elektroforezy. W bardziej wyrafinowanych wariantach techniki stosuje się elektroforezę kapilarną.
Tak więc dłuższe pasma poruszają się mniej niż krótsze warianty. System ten następnie przechodzi przez czytnik, który rozpoznaje marker zawarty w każdym dideoksynukleotydzie. W ten sposób można poznać kolejność sekwencji.
Ta technika „pierwszej generacji” jest w stanie odczytać fragmenty DNA nie większe niż 1 kilozasad. Obecnie metoda Sangera stosowana jest w różnych laboratoriach, generalnie w jej nowoczesnych odmianach. Ponadto służy do potwierdzania wyników uzyskanych za pomocą najbardziej złożonych technik - ale mniej precyzyjnych..
Gdy sekwencjonowanie jest wymagane na dużą skalę, proces jest przyspieszany dzięki automatyzacji. Jest to odmiana metody terminacji łańcucha Sangera, w której startery są znakowane produktami fluorescencyjnymi w celu ich rozróżnienia..
Następnie produkt reakcji poddaje się elektroforezie - wszystko na jednym torze. Kiedy każdy fragment opuszcza ostatnią część żelu, jest szybko identyfikowany przez znakowanie fluorescencyjne, z błędem około 1%..
Najbardziej wyrafinowane systemy mają system do 96 rurek kapilarnych zarządzanych przez komputer połączony z robotem. Oznacza to, że jednocześnie można badać 96 próbek DNA. Dzięki temu proces obejmujący elektroforezę i analizę wyników jest w pełni zautomatyzowany..
W ciągu jednego dnia systemy te mogą sekwencjonować do 550 000 zasad. Podczas tego procesu praca ludzka jest zbędna, uruchomienie metody zajmuje tylko około 15 minut.
W tym samym czasie, gdy Sanger opublikował swoją pracę, dwóm badaczom, imieniem Allan Maxan i Walter Gilbert, udało się opracować inną metodę uzyskiwania sekwencji DNA. Metoda zyskała wówczas popularność, ale później została wyparta przez udoskonalenie metody Sangera..
W przeciwieństwie do metody Sangera, sekwencjonowanie Maxana i Gilberta (lub sekwencjonowanie chemiczne, jak jest również znane) nie obejmuje reakcji hybrydyzacji. Metodologia polega na znakowaniu z jednej strony czynnikami reaktywnymi, a następnie na procesie oczyszczania..
Jednym z negatywnych aspektów tej techniki jest jej ogromna złożoność oraz użycie niebezpiecznych dla użytkownika chemikaliów. Rozkłady chemiczne są wywoływane przez zastosowanie DMS, kwasu mrówkowego, hydrazyny i hydrazyny z solami.
Protokół rozpoczyna się od znakowania na końcu 5 'nici markerem fosforowym 32, po czym następuje chemiczna modyfikacja zasady azotowej i jest ona oddzielana. Wreszcie następuje rozszczepienie regionu bezzasadowego.
Najpierw łańcuch do sekwencjonowania jest skracany na mniejsze segmenty. Ten krok jest wykonywany z enzymami restrykcyjnymi, które powodują wystające końce..
Następnie przeprowadza się reakcję z alkaliczną fosfatazą, której celem jest wyeliminowanie grupy fosforanowej. Zatem do wykonania znakowania można zastosować kinazę polinukleotydową..
Łańcuszek jest zdenaturowany (dwie nici otwarte). Następnie nakłada się chemikalia. Te reakcje rozszczepienia są przeprowadzane w sposób kontrolowany i wiadomo, jakie typy wiązań każde zastosowane chemiczne pęknięcie..
Podobnie jak w metodzie Sangera, odczyt wyników obejmuje rozdział według rozmiaru łańcuchów uzyskanych w systemie elektroforezy. Systemy złożone z poliakryloamidu pozwalają na uzyskanie bardzo odpowiedniej rozdzielczości do odczytu żelu.
Masowe sekwencjonowanie obejmuje szereg nowatorskich metod, w skrócie NGS, z języka angielskiego ”Sekwencjonowanie nowej generacji ”.
Metody sklasyfikowane jako NGS wymagają wcześniejszego etapu amplifikacji DNA (nie działają z pojedynczą cząsteczką). Ponadto używane platformy są bardzo zróżnicowane. Zasady najpopularniejszych metod zostaną opisane poniżej:
Obejmuje monitorowanie uwalniania pirofosforanu, które ma miejsce za każdym razem, gdy do nici DNA dodaje się nowy nukleotyd. Układ enzymatyczny jest sprzężony, dzięki czemu emisja światła (wykrywalnego przez kamerę) następuje za każdym razem, gdy wprowadzany jest nowy nukleotyd.
Proces rozpoczyna się od oddzielnej inkubacji każdej zasady azotowej w celu sprawdzenia, czy występuje emisja światła. Pirosekwencjonowanie może odczytywać długie pasma, ale znaleziony współczynnik błędów jest wysoki.
Obejmuje to włączenie wyznakowanych nukleotydów. Te składniki fluorescencyjne są dodawane, przemywane i odnotowywany jest wprowadzony nukleotyd. Następnie znacznik nukleotydowy jest usuwany i synteza nici może być kontynuowana. W następnym kroku zostanie również wbudowany wyznakowany nukleotyd i powyższe kroki zostaną powtórzone..
Wadą tej techniki jest sytuacja, gdy znaczniki fluorescencyjne nie są całkowicie usunięte. Te emisje powodują błędy w tle, co prowadzi do znacznych błędów.
Ta technika różni się od innych, ponieważ nie wykorzystuje polimerazy DNA. Zamiast tego kluczowym enzymem stosowanym w tej metodologii jest ligaza. Tutaj używane są fragmenty DNA znakowane fluorescencyjnie, które są ligowane przez enzym i wykrywane.
Największym problemem związanym z tą techniką jest krótka długość fragmentu, który jest w stanie przetworzyć..
Technika ta opiera się na pomiarze jonu H.+ który jest uwalniany za każdym razem, gdy włączany jest nowy nukleotyd. Zasada jest dość podobna do pirosekwencjonowania, ale znacznie tańsza.
Sekwencjonowanie ludzkiego genomu jest jednym z najbardziej obiecujących wyzwań w biologii, a także jedną z najbardziej uznanych rywalizacji w historii nauki. W rzeczywistości dla naukowców zaangażowanych w projekt sekwencjonowanie genomu stało się konkurencją..
W 1990 roku rozpoczął tak zwany „projekt ludzkiego genomu”, prowadzony przez słynnego naukowca, laureata Nagrody Nobla, Jamesa Watsona. Po roku, w 1991 roku, Venter podejmuje wyzwanie „pokonania” Watsona i sekwencjonowania genomu przed nim. Jednak w 1992 roku Watson przeszedł na emeryturę, a dowództwo przejął inny badacz.
W 1995 roku Venter ogłosił swój sukces w całkowitym sekwencjonowaniu genomu bakteryjnego metodą sekwencjonowania losowego. Podobnie przeciwna drużyna rok później ogłosiła sekwencjonowanie genomu drożdży..
W 2000 roku wyścig został przerwany. Obie firmy opublikowały wstępne wyniki całego genomu w dwóch najbardziej prestiżowych czasopismach naukowych: Natura Y Nauka.
Jednak naukowcy kontynuowali prace nad ulepszeniem propozycji, aw 2006 r. Ukończono sekwencje niektórych ludzkich chromosomów..
Znajomość kolejności nukleotydów cząsteczki tak ważnej jak DNA jest cenna dla biologów i pokrewnych im specjalistów. Ten łańcuch polinukleotydów zawiera wszystkie informacje niezbędne do rozwoju i utrzymania wszystkich form życia..
Z tych powodów znajomość tej sekwencji jest niezbędna do badań biologicznych. Zasadniczo sekwencjonowanie pozwala zmierzyć jedną z najważniejszych właściwości systemów biologicznych i ustalić różnice między nimi..
Sekwencjonowanie jest szeroko stosowane przez taksonomistów i systematyków, ponieważ niektóre sekwencje DNA pozwalają na ustalenie kryteriów pozwalających stwierdzić, czy dwa organizmy należą do tego samego gatunku, a ponadto są w stanie zaproponować hipotezy dotyczące relacji filogenetycznych między nimi..
Ponadto sekwencjonowanie DNA ma zastosowanie w medycynie i diagnostyce. Na przykład istnieją niedrogie i dostępne systemy, które poprzez sekwencjonowanie umożliwiają ocenę tendencji do rozwoju niektórych chorób (np. Raka) przy użyciu tak zwanych polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP)..
Śledztwa kryminalistyczne i kryminalistyczne wzbogacono również o techniki sekwencjonowania, które mogą posłużyć jako wiarygodny dowód udziału danej osoby w przestępstwie.
Jeszcze bez komentarzy